基因工程制藥

1、第二節(jié) 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng),一、原核表達(dá)系統(tǒng),概念：廣義的原核表達(dá)，是指發(fā)生在原核生物內(nèi)的基因表達(dá)。狹義的原核表達(dá)，常出現(xiàn)于生物工程中。是指通過基因克隆技術(shù)，將外源目的基因，通過構(gòu)建表達(dá)載體并導(dǎo)入表達(dá)菌株的方法，使其在特定原核生物或細(xì)胞內(nèi)表達(dá),一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株。如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩砜紤]，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的

2、活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。,表達(dá)載體　　為了獲得高水平的基因表達(dá)產(chǎn)物，人們通過綜合考慮控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及向胞外分泌等諸多方面的因素，設(shè)計(jì)出了許多具有不同特點(diǎn)的表達(dá)載體，以滿足表達(dá)不同性質(zhì)、不同要求的目的基因的需要。 　　通常關(guān)心的表達(dá)載體質(zhì)粒上的元件包括：啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、終止密碼、融合Tag（如果有的話）、復(fù)制子、篩選標(biāo)記或報(bào)告基因等。,啟動(dòng)子　　啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組

3、成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動(dòng)子。,終止子　　轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)有重要作用，即控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動(dòng)子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見的是rrnB rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子

4、。,核糖體結(jié)合位點(diǎn)　　啟動(dòng)子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3‘端互補(bǔ)的SD序列對形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動(dòng)子下游都有SD序列，也有些載體沒有 。,原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)在于能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。,缺點(diǎn)：原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點(diǎn)：如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無法對表達(dá)時(shí)間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒

5、害作用，過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低 。,,為克服上述不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點(diǎn)是 ①根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計(jì)，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制 ②能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及； ③能嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，即不僅

6、可控制基因表達(dá)的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量 因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。,酵母表達(dá)系統(tǒng),酵母是一類低等的單細(xì)胞真核生物，作為一種外源基因的表達(dá)系統(tǒng)相對于其他表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于，它既具有真核細(xì)胞的特性又具有類似于原核細(xì)胞的生長特點(diǎn)。酵母系統(tǒng)包括多種細(xì)胞因子、多肽激素等。酵母系統(tǒng)表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)在于原核表達(dá)系統(tǒng)

7、相比酵母是真核生物，可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行修飾，有利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性；而且可將表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物分泌到胞外不僅有利于產(chǎn)品的純化，還避免地表達(dá)系統(tǒng)的過度積累對宿主產(chǎn)生不利影響；而對哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比酵母更易于培養(yǎng)，可進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，故在表達(dá)外源蛋白，特別是大分子真核生物蛋白方面得到了廣泛的應(yīng)用。,酵母表達(dá)系統(tǒng)載體,酵母表達(dá)系統(tǒng)的載體一般用穿梭載體，穿梭載體可以在酵母和大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制，它是由酵母野生型質(zhì)粒、抗性基因、宿主

8、染色體DNA上自主復(fù)制序列（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等組成的。酵母中用于表達(dá)外源基因的常用表達(dá)載體一般可以分為兩種，即整合體型表達(dá)載體和附加體型表達(dá)載體。,常用的酵母表達(dá)系統(tǒng),釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)甲醇營養(yǎng)性酵母表達(dá)系統(tǒng)裂植酵母表達(dá)系統(tǒng)在酵母中表達(dá)外源基因的步驟1、外源基因克隆2、轉(zhuǎn)化酵母菌3、篩選并鑒定轉(zhuǎn)化子4、外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),概念：昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真

9、核表達(dá)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體，可使很多真核目的的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。BEVS應(yīng)用于外源蛋白表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是：它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工能力，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白；其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的50%；可表達(dá)非常大的外源性基因；具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外援金銀的能力；對脊椎動(dòng)物是安全的。,桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法,

10、將目的基因克隆到合適的載體，置于桿狀病毒啟動(dòng)子控制之下。用重組的轉(zhuǎn)移載體和相應(yīng)的野生型或改造過的野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞。篩選重組病毒。擴(kuò)增病毒以進(jìn)行大規(guī)模的蛋白生產(chǎn)。純化表達(dá)的外源蛋白。,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),按照宿主細(xì)胞的類型，可將基因表達(dá)系統(tǒng)大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。與其它系統(tǒng)相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯

11、后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。從最開始以裸露DNA直接轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞至今的30余年間，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不僅已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺，在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起了極為重要的作用。本文主要從表達(dá)系統(tǒng)及其兩個(gè)組成部分——表達(dá)載體和宿主細(xì)胞等方面，簡要介紹哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和相關(guān)的研究進(jìn)展。,研究現(xiàn)狀,①部分蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)已從實(shí)驗(yàn)室研究

12、邁向生產(chǎn)或中試生產(chǎn)階段。②已有許多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)和大量制備、生產(chǎn)。如人組織型血纖蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干擾素、乙肝表面抗原、紅血球生成激素、人生長激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些產(chǎn)品已投入臨床應(yīng)用或試用。③雖然經(jīng)過多年努力，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平有大幅度增高，但從整個(gè)水平上看仍偏低，一般處在雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體蛋白產(chǎn)率的下限，即1-30μg/l08細(xì)胞/24小時(shí)。有人認(rèn)為其限速步驟

13、可囂是在工程細(xì)胞中(對于重組蛋白來講，常是異源的)，重組蛋白的分泌效率較低。,,1 表達(dá)載體 1．1 表達(dá)栽體的類型哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞需幾周甚至幾個(gè)月時(shí)間，而利用病毒表達(dá)系統(tǒng)則可快速感染細(xì)胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達(dá)產(chǎn)物中檢測出目的蛋白。根據(jù)進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式，可將表達(dá)載體分為病毒載體與質(zhì)粒載體。病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過

14、病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外源基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。常用的病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、semliki森林病毒(sFv)載體等。另外，桿狀病毒載體應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)在近幾年頗受重視，這是因?yàn)樗c其它病毒載體相比有特有優(yōu)勢，如可通過昆蟲細(xì)胞大量制備病毒顆粒；可感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但在細(xì)胞內(nèi)無復(fù)制能力，生物安全度高；可插入高達(dá)38 kb的外源基因等。質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學(xué)的作用導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)。依據(jù)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞

15、內(nèi)是否具有自我復(fù)制能力，可將質(zhì)粒載體分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無復(fù)制能力，需整合于宿主細(xì)胞染色體內(nèi)方能穩(wěn)定存在，如SV40病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體和游離型如痘苗病毒、腺病毒載體。利用 Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒載體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白在結(jié)構(gòu)與功能上與天然哺乳動(dòng)物來源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒載體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得的外源蛋

16、白占細(xì)胞總蛋白的；而附加體型載體則是在細(xì)胞內(nèi)以染色體外可自我復(fù)制的附加體形式存在。整合型載體一般是隨機(jī)整合入染色體，其外源基因的表達(dá)受插入位點(diǎn) 的影響，同時(shí)還可能會(huì)改變宿主細(xì)胞的生長特性。相比之下，附加體型載體不存在這方面的 問題，但載體DNA在復(fù)制中容易發(fā)生突變或重排。,轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng),自從20世紀(jì)80年代初利用植物基因工程技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植物以來，植物生物技術(shù)得到了快速發(fā)展。伴隨著植物生物技術(shù)發(fā)展，植物體作為生物反應(yīng)器正在成為外源

17、基因表達(dá)的重要體系，利用植物外源重組蛋白生成藥用蛋白或疫苗是轉(zhuǎn)基因植物研究的一個(gè)焦點(diǎn)。,轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)重組蛋白的一般步驟,1、基因的克隆 2、轉(zhuǎn)化 3、表達(dá) 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)的分類1、穩(wěn)定的整合表達(dá)系統(tǒng)2、瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)3、葉綠體轉(zhuǎn)化植物,具有直接使用可食性植物原料的可能性植物是一個(gè)能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的廉價(jià)生產(chǎn)系統(tǒng)，在獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株后，擴(kuò)大耕種面積就能提高蛋白的產(chǎn)量，隨著種植面積的增加，產(chǎn)量可按比例快速增加。植物

18、具有完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，可加工多聚體蛋白因?yàn)橹参锊怀洚?dāng)人類病原體的宿主，因此更具安全性,轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)重組蛋白的優(yōu)點(diǎn),轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng),將外源重組基因轉(zhuǎn)染并整合到動(dòng)物受體細(xì)胞基因組中，從而形成在體表達(dá)外源基因的動(dòng)物，稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，包括外源基因、表達(dá)載體和受體細(xì)胞等，基因組的轉(zhuǎn)移則是細(xì)胞核移植和動(dòng)物克隆技術(shù)，人工合成與設(shè)計(jì)基因、全基因乃至基因組的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是合成生物學(xué)。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指將特定

19、的外源基因?qū)珓?dòng)物受精卵或胚胎，使之穩(wěn)定整合于動(dòng)物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。 　　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所有的細(xì)胞均整合有外源基因，并具有將外源基因遺傳給子代的能力，若動(dòng)物只有部分組織細(xì)胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動(dòng)物，這類動(dòng)物只有在整合了外源基因的“部分組織細(xì)胞”恰為生殖細(xì)胞時(shí)，才能將其攜帶的外源基因遺傳給子代。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn),1．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成功率低 陽性率結(jié)果重復(fù)性差，甚至無法重復(fù)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率較低。隨后的

20、研究雖然使成功率有所提高，但總的成功率還是較低，限制了其應(yīng)用的發(fā)展。建立更完善的轉(zhuǎn)基因方法。使用大的外源DNA片段。 2．造成宿主基因突變問題 外源基因在動(dòng)物基因組中的隨機(jī)整合，可能會(huì)引起宿主細(xì)胞基因的插入突變、缺失突變及宿主基因的擴(kuò)增重排和移位，也可能激活正常狀態(tài)下處于關(guān)閉狀態(tài)的基因，從而導(dǎo)致動(dòng)物表型的改變甚至造成動(dòng)物不育或死亡?；虼虬屑夹g(shù)（gene targeting）能夠使目的基因定點(diǎn)整合，因此避免了對宿主基因的損傷，提高了陽性

21、率。 3．外源基因表達(dá)水平不高 轉(zhuǎn)入的外源目的基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中是否高效表達(dá)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究成敗的關(guān)鍵。對外源基因的整合機(jī)理進(jìn)行深入研究。選擇表達(dá)效率高的啟動(dòng)子。,4．安全性問題 插入的外源基因是否會(huì)影響宿主動(dòng)物自身的基因表達(dá)及表達(dá)水平；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是否可能會(huì)把外源基因傳遞給生活在其周圍的其它種群及環(huán)境，造成基因污染；在病毒等致病基因的轉(zhuǎn)基因研究中，不可避免地會(huì)產(chǎn)生一些有害的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，是否可能因?yàn)槭褂棉D(zhuǎn)基因動(dòng)物制品而將一些動(dòng)物性疾病傳遞

22、給人類。 將編碼活性蛋白的基因?qū)雱?dòng)物的受精卵或早期胚胎內(nèi)以制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并使外源基因在動(dòng)物體內(nèi) (乳汁、血液等 )高效表達(dá)，然后再分離提取目的基因編碼產(chǎn)物。動(dòng)物就像一個(gè)活的發(fā)酵罐。其溫度、氣體、水分和pH值均由動(dòng)物自身調(diào)節(jié)。所以有人把它喻為藥物工廠、生物反應(yīng)器、基因農(nóng)場或分子農(nóng)場（molecular farming）。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，其特點(diǎn)有：表達(dá)產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性，產(chǎn)品成本低，并可進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)；產(chǎn)品