中國(guó)藥典2005年版無(wú)菌、微生物限度及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容簡(jiǎn)介

1、2006年8月,1,中國(guó)藥典2005年版無(wú)菌、微生物限度及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容簡(jiǎn)介,2006.8,2006年8月,2,主要內(nèi)容,1、無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)及常見(jiàn)問(wèn)題2、微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)及常見(jiàn)問(wèn)題3、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)及常見(jiàn)問(wèn)題,2006年8月,3,無(wú)菌檢查的方法學(xué)驗(yàn)證,相關(guān)規(guī)定無(wú)菌檢查驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證中常見(jiàn)的問(wèn)題,2006年8月,4,一、相關(guān)規(guī)定 藥品無(wú)菌和微生物限度檢查方法驗(yàn)證作為中國(guó)藥

2、典2005年版增訂的一項(xiàng)重要內(nèi)容對(duì)促進(jìn)我國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化是十分重要和必要的，執(zhí)行近一年以來(lái)的情況表明，方法驗(yàn)證是促使我國(guó)藥品無(wú)菌和微生物限度檢查方法更加合理、科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹匾緩健＃?006年6月全國(guó)會(huì)議紀(jì)要）,2006年8月,5,中檢所和藥典會(huì)多次召開(kāi)會(huì)議肯定工作的成績(jī)、研討存在的問(wèn)題，希望各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)能給予高度重視，從各方面支持這項(xiàng)工作長(zhǎng)期持續(xù)發(fā)展。 實(shí)際工作中，藥品生產(chǎn)、研發(fā)企業(yè)和各級(jí)藥檢所在工作中都存在很多困難和問(wèn)題。,

3、2006年8月,6,關(guān)于執(zhí)行《中國(guó)藥典》2005年版微生物限度檢查法和無(wú)菌檢查法有關(guān)問(wèn)題的說(shuō)明國(guó)藥典發(fā)[2005]98號(hào),各藥品檢驗(yàn)所：    根據(jù)國(guó)食監(jiān)注[2005]234號(hào)“關(guān)于頒布和執(zhí)行《中國(guó)藥典》2005年版有關(guān)事宜的通知”規(guī)定，《中國(guó)藥典》7月1日起開(kāi)始執(zhí)行，各藥品檢驗(yàn)所在執(zhí)行“微生物限度檢查法”和“無(wú)菌檢查法”過(guò)程中遇到了一些問(wèn)題，為保證《中國(guó)藥典》2005年版的順利實(shí)施，現(xiàn)就有關(guān)問(wèn)題說(shuō)明如

4、下：,2006年8月,7,1．“微生物限度檢查”和“無(wú)菌檢查”是藥品安全性檢查的重要項(xiàng)目。雖然近幾版《中國(guó)藥典》均收載有“微生物限度檢查法”和“無(wú)菌檢查法”，但在如何保證檢驗(yàn)方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性方面與國(guó)外藥典相比仍具有一定差距，其關(guān)鍵是《中國(guó)藥典》未強(qiáng)調(diào)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行必要的方法驗(yàn)證。為此，藥典會(huì)設(shè)立專項(xiàng)科研課題，對(duì)2005年版《中國(guó)藥典》的“微生物限度檢查法”和“無(wú)菌檢查法”增加驗(yàn)證試驗(yàn)的必要性進(jìn)行研討。根據(jù)研究結(jié)果，2005

5、年版《中國(guó)藥典》規(guī)定當(dāng)進(jìn)行藥品的“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”時(shí)應(yīng)進(jìn)行方法驗(yàn)證。,2006年8月,8,,驗(yàn)證的目的是為了確認(rèn)試驗(yàn)中供試品應(yīng)選擇藥典中所收載的何種供試液制備方法、何種測(cè)定方法及確定的檢測(cè)系統(tǒng)是否適用于該供試品的檢驗(yàn)，即只有通過(guò)方法驗(yàn)證，才能確定供試品的檢驗(yàn)條件和方法，保證“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。,2006年8月,9,2．不同企業(yè)生產(chǎn)的相同品種，特別是中成藥，因原料來(lái)源、工藝、輔料的

6、不同，藥品可能表現(xiàn)出不同的抑菌特性；同一個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的相同品種，因原料來(lái)源不同、工藝改變或不同實(shí)驗(yàn)室等原因，也可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的差異。因此，不同企業(yè)生產(chǎn)的相同品種進(jìn)行“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”時(shí)，其具體試驗(yàn)方法如沖洗量等不能簡(jiǎn)單照搬，需通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)核實(shí)該試驗(yàn)方法和檢測(cè)系統(tǒng)是否適宜。,2006年8月,10,3．目前各藥檢所涉及的檢驗(yàn)工作可分為三類：注冊(cè)檢驗(yàn)（包括進(jìn)口注冊(cè)和新藥注冊(cè)）、監(jiān)督抽驗(yàn)和進(jìn)口檢驗(yàn)?？紤]到各檢驗(yàn)性質(zhì)的差異，各口岸所

7、在進(jìn)行進(jìn)口復(fù)核及進(jìn)口檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)請(qǐng)企業(yè)提供方法驗(yàn)證材料或詳細(xì)的SOP資料進(jìn)行審核；各口岸所完成復(fù)核時(shí)應(yīng)在修訂的進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中明確“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”的關(guān)鍵操作點(diǎn)（如供試品的處理方法等）及試驗(yàn)方法（如平皿法、薄膜過(guò)濾法、直接接種法等），并在復(fù)核說(shuō)明中概述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以方便以后的進(jìn)口檢驗(yàn)。,2006年8月,11,,對(duì)國(guó)內(nèi)新藥的注冊(cè)檢驗(yàn)，也應(yīng)請(qǐng)企業(yè)提供方法驗(yàn)證資料，如果企業(yè)提供不出方法學(xué)驗(yàn)證資料，根據(jù)藥品注冊(cè)管理辦法，應(yīng)在審核意見(jiàn)

8、中明確指出“方法學(xué)未經(jīng)驗(yàn)證，無(wú)法檢驗(yàn)”，并建議企業(yè)重新建立“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”方法。監(jiān)督抽驗(yàn)藥品，由于2005年版以前歷版《中國(guó)藥典》未強(qiáng)調(diào)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，故各藥檢所目前在進(jìn)行具體品種檢驗(yàn)時(shí)難度較大，故也應(yīng)請(qǐng)企業(yè)提供方法驗(yàn)證資料并進(jìn)行審核，未經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證的“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”結(jié)果，決不能給出“符合2005年版《中國(guó)藥典》的規(guī)定”的結(jié)論。,2006年8月,12,國(guó)家藥典委員會(huì)    

9、;                              中國(guó)藥品生物制品檢定所     &#

10、160;                            二00五年十月十一日,2006年8月,13,● 驗(yàn)證的目的: 驗(yàn)證所采用的方法和條件是否適合于供試品的無(wú)菌

11、檢查。 即確認(rèn)供試品在該檢驗(yàn)量、該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不計(jì)。 ● 驗(yàn)證的意義：保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。,,2006年8月,14,二、無(wú)菌檢查驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證的類型●前驗(yàn)證: 建立藥品的微生物限度檢查法和無(wú)菌檢查法時(shí)（當(dāng)建立藥品的無(wú)菌或微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無(wú)菌檢查）?！裨衮?yàn)證: 修訂的檢驗(yàn)方法;供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生

12、改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí) ;定期的方法驗(yàn)證（若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證） 。,2006年8月,15,無(wú)菌檢查驗(yàn)證用菌株：,金黃色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26 003]銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10 104] **擬修訂為大腸埃希菌枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) [CMCC

13、(B) 63 501]生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003],2006年8月,16,菌株選擇的原則:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,標(biāo)準(zhǔn)菌株(或該藥品中常見(jiàn)的污染菌)。菌名 分類

14、 芽孢 對(duì)氧需求銅綠假單胞菌 革蘭氏陰性桿菌 無(wú)芽孢 需氧枯草芽孢桿菌 革蘭氏陽(yáng)性桿菌 有芽孢 需氧金黃色葡萄球菌 革蘭氏陽(yáng)性球菌 無(wú)芽孢 需氧大腸埃希菌 革蘭氏陰性短桿菌 無(wú)芽孢 需氧生孢梭菌 梭菌 有芽孢 厭氧,2006年8月,17,

15、菌種的要求： 傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。加菌量:＜100cfu。 驗(yàn)證時(shí)，按“供試品的無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每—試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。,2006年8月,18,菌液制備,接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培

16、養(yǎng)18-24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu(菌落形成單位)的菌懸液。,2006年8月,19,,接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23~28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，吸出孢子懸液(用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管)至無(wú)

17、菌試管內(nèi)，用0.9％無(wú)菌氧化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。,2006年8月,20,,驗(yàn)證方法： 直接接種法 薄膜過(guò)濾法,2006年8月,21,薄膜過(guò)濾法,將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按規(guī)定溫度

18、培養(yǎng)3～5天。各試驗(yàn)菌同法操作。,2006年8月,22,直接接種法,取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100cfu的白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接人規(guī)定量的供試品，另1管作為對(duì)照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5天。,2006年8月,23,結(jié)果判斷：,與對(duì)照管比較，如含

19、供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。 如含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用。,2006年8月,24,消除供試品抑菌的方法,增加沖洗量增加培養(yǎng)基的用量使用中和劑或滅活劑： β-內(nèi)酰胺酶、對(duì)氨基苯甲酸 更換濾膜品種注意：重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。,2006年8月

20、,25,方法學(xué)驗(yàn)證資料試驗(yàn)記錄要點(diǎn),總的要求：詳細(xì)、嚴(yán)謹(jǐn)、可操作性供試品信息檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量：按照無(wú)菌檢查的量確定供試品處理、供試品溶液的制備檢驗(yàn)方法（選擇直接接種法說(shuō)明理由）實(shí)驗(yàn)用菌 代數(shù)、稀釋級(jí)、計(jì)數(shù)檢驗(yàn)條件：主要是沖洗條件（沖洗液、沖洗次數(shù)、量，必要時(shí)說(shuō)明濾膜材質(zhì)、儀器、泵速等條件）。需要中和、酶處理等特殊處理方法的需說(shuō)明逐日記錄各菌的生長(zhǎng)情況,2006年8月,26,方法學(xué)驗(yàn)證資料試驗(yàn)結(jié)論,采用的方法：薄膜過(guò)濾法

21、/直接接種法關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)點(diǎn)：如沖洗條件、中和、酶處理等因素,2006年8月,27,三、驗(yàn)證及資料中常見(jiàn)的問(wèn)題薄膜過(guò)濾法加菌的時(shí)機(jī)不一致（供試品中和陽(yáng)性對(duì)照中）,按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽(yáng)性菌液，而驗(yàn)證試驗(yàn)主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對(duì)陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)的影響，可以與對(duì)照濾器比較而作出判斷，所以驗(yàn)證試驗(yàn)中加菌時(shí)機(jī)要與對(duì)照一致（中檢所講義）。,2006年8月,28,薄膜過(guò)濾法濾膜材質(zhì)選擇不正確，直接影響試驗(yàn)結(jié)果,普通濾膜有機(jī)膜低吸附濾

22、膜1.根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。2.應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。3.采用全封閉過(guò)濾器注意觀察膜的狀態(tài)，某些油性供試品或采用蓖麻油等作為溶媒的供試品可以損傷普通濾膜。,2006年8月,29,驗(yàn)證試驗(yàn)：按規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5天 無(wú)菌檢查：陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)48～72h應(yīng)生長(zhǎng)良好,驗(yàn)證試驗(yàn)與無(wú)菌檢查培養(yǎng)觀察時(shí)間是不同的，不加區(qū)分影響對(duì)陽(yáng)性菌生長(zhǎng)緩慢的判斷,2006年8月,30,,敏感菌株與陽(yáng)性對(duì)照菌不一致，降低了陽(yáng)性對(duì)照菌的

23、意義 陽(yáng)性對(duì)照菌不是驗(yàn)證試驗(yàn)選定的敏感菌株實(shí)際工作中抑制枯草芽孢桿菌的樣品很多（敏感菌株），但陽(yáng)性對(duì)照只能選擇金黃色葡萄球菌。,2006年8月,31,關(guān)于大腸埃希菌的問(wèn)題,供試品無(wú)菌檢查中規(guī)定“抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌”，但在方法學(xué)驗(yàn)證中所用菌株沒(méi)有大腸埃希菌。解決措施：抗革蘭陰性菌的抗菌藥物進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)增加大腸埃希菌。即將修訂，將銅綠假單胞菌修訂為大腸埃希菌。修訂后按新方法執(zhí)行。,2006年8月,32

24、,薄膜過(guò)濾法和直接接種法如：一般供試品（無(wú)特殊說(shuō)明），完全可以采用薄膜過(guò)濾法，而生產(chǎn)單位進(jìn)行的無(wú)菌檢查驗(yàn)證法為直接接種法。也有的廠家把兩種方法的驗(yàn)證都寫(xiě)上，結(jié)論中也沒(méi)有說(shuō)明采用那種方法。CP2005：無(wú)菌檢查法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。修訂：改為薄膜過(guò)濾法重新進(jìn)行驗(yàn)證。,方法選擇錯(cuò)誤，不符合CP2005版要求,2006年8月,33,進(jìn)行供試品無(wú)菌檢查時(shí)，所采用的檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的

25、方法相同。結(jié)合無(wú)菌檢查檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量確定驗(yàn)證時(shí)取樣量。如同時(shí)進(jìn)行無(wú)菌檢查一定要按照規(guī)定的檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量取樣。,檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量與驗(yàn)證試驗(yàn)的量不同，與CP2005版驗(yàn)證要求不符,2006年8月,34,生產(chǎn)單位進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)檢驗(yàn)數(shù)量要按照表1 批出廠產(chǎn)品最少檢驗(yàn)數(shù)量。檢驗(yàn)量（每只樣品接入每種培養(yǎng)基的最少樣品量）同上市抽驗(yàn)品種。無(wú)菌檢查法中規(guī)定：只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過(guò)濾。因此，驗(yàn)證試驗(yàn)中檢驗(yàn)量就多不就少，

26、如10ml注射液，雖然每個(gè)濾膜每容器取2ml也符合藥典規(guī)定，10支分配至3個(gè)或更多濾筒也可，但建議取15支分3個(gè)濾筒（貴重藥品和抗生素品種可靈活掌握，但不能低于最少量）。,2006年8月,35,舉例說(shuō)明上市抽驗(yàn)樣品無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證檢驗(yàn)量（液體制劑）≤1ml 每個(gè)菌10支,共60支（全取樣）1＜V＜5 共30（取樣量為半量）5≤V＜20 建議30（取樣量為2ml，建議全部過(guò)濾）20≤V＜50 建議30（取樣

27、量為5ml，建議全部過(guò)濾）50≤V＜100 建議30（取樣量為10ml，建議全部過(guò)濾)50≤V＜100（靜脈給藥） 共30（取樣量為半量）100≤V≤500 共18（取樣量為半量）＞500,2006年8月,36,對(duì)檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量的把握應(yīng)考慮便于實(shí)際操作，比如處理100ml/袋的樣品，取9袋樣品一次分配到一組三聯(lián)濾器，檢驗(yàn)數(shù)量大于藥典規(guī)定的6個(gè)，但檢驗(yàn)量似乎不符合藥典規(guī)定的每袋樣品取半量檢驗(yàn)的規(guī)定，僅為1/3，但根據(jù)藥典檢驗(yàn)量即

28、為一次試驗(yàn)所用供試品總量（g或ml）的解釋，這與先將6袋分配兩個(gè)濾筒，再將剩下3袋抽入一個(gè)濾筒作為樣定對(duì)照的方法一樣，卻更節(jié)省時(shí)間。（中檢所講義）,2006年8月,37,沖洗條件、沖洗量的選擇太盲目,有些廠家提供的驗(yàn)證資料中，對(duì)非抑菌性供試品也采用大量的沖洗，100ml/次*10次/膜，增加了出現(xiàn)誤差的機(jī)會(huì)。1. 對(duì)膜的損傷2. 檢驗(yàn)方法繁瑣，大大增加檢驗(yàn)人員的工作量（檢驗(yàn)要按照已經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行）3. 驗(yàn)證試驗(yàn)方法選擇總的原則是

29、由易到難,2006年8月,38,沖洗不一定為100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振搖。對(duì)于抑菌性較強(qiáng)的供試品，可以先用適宜的稀釋液稀釋后再過(guò)濾，以減少膜的吸附, 減少?zèng)_洗量。如：抗生素品種取規(guī)定量，混合至含適量稀釋液（如500ml等)的無(wú)菌容器中，然后再過(guò)濾。對(duì)于抑菌性較強(qiáng)的注射用無(wú)菌粉末或固體原料，一定要充分溶解、混合均勻?？咕幙梢愿鶕?jù)其抗菌譜選擇敏感菌先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，找到合適的條件再進(jìn)行其他菌的實(shí)驗(yàn)。采用開(kāi)放

30、式薄膜過(guò)濾器：濾膜分成幾份與取樣量、沖洗條件的選擇有關(guān)，建議盡量與無(wú)菌檢查法一致（最常見(jiàn)為3等分）。,2006年8月,39,方法描述不夠詳細(xì)，沒(méi)有可操作性,如某產(chǎn)品驗(yàn)證資料“將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100CFU的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至……中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒中”。驗(yàn)證的目的是為了“照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查”，方法確立后，以后該產(chǎn)品就可以采用該方法進(jìn)行檢驗(yàn)。應(yīng)記錄取樣量

31、、（稀釋方法）、沖洗液、沖洗量（沖洗條件）等。,2006年8月,40,特殊情況,眼用液體制劑：制劑通則中規(guī)定，眼用液體制劑微生物限度檢查法為“除另有規(guī)定外，按薄膜過(guò)濾法或直接接種法檢查，至少?gòu)?支供試品抽取規(guī)定量（每種培養(yǎng)基各接種2支，每支1ml），直接或處理后接種于硫乙醇流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7天，不得有菌生長(zhǎng)。若有菌生長(zhǎng)，應(yīng)重新取2倍量供試品，分別依法復(fù)試，各管均不得有菌生長(zhǎng)?！毖塾靡后w制劑微生物限度檢查的方法驗(yàn)證同無(wú)

32、菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證。,2006年8月,41,微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證,概述微生物檢查驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證中常見(jiàn)的問(wèn)題,2006年8月,42,一、概述,微生物限度檢查法驗(yàn)證的目的：確認(rèn)所采用的方法是否適合于供試品的微生物限度檢查。驗(yàn)證的內(nèi)容：包括準(zhǔn)確性(回收率)、專屬性。驗(yàn)證的類型：前驗(yàn)證(建立微生物限度檢查法時(shí)的驗(yàn)證)和再驗(yàn)證(修訂檢驗(yàn)方法后、供試品組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)、定期的方法驗(yàn)證)。,2006年8月,43

33、,,根據(jù)檢查方法的不同分為： 細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證和控制菌檢查法的驗(yàn)證。驗(yàn)證的意義：保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。,2006年8月,44,總體思路與程序,某些供試品含有抗微生物物質(zhì)，使供試品中的活微生物的生長(zhǎng)被抑制，不能按常規(guī)方法檢驗(yàn)，必須以適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蛞种乒┰嚻分锌刮⑸镂镔|(zhì)的活性后，活微生物才能生長(zhǎng)，得以檢出。通過(guò)消除或抑制供試品中抗微生物物質(zhì)的活性來(lái)檢測(cè)微生物的方法，應(yīng)通過(guò)驗(yàn)證，以確定所用檢測(cè)

34、方法測(cè)定結(jié)果的可信度。,2006年8月,45,需要驗(yàn)證的環(huán)節(jié),驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗(yàn)證），保證其對(duì)結(jié)果判斷沒(méi)有影響。前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)在驗(yàn)證的范圍內(nèi)。已有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程（SOP）和充足實(shí)驗(yàn)證明的前處理方法可以直接采用，但出現(xiàn)疑問(wèn)應(yīng)進(jìn)一步研究提高。 供試品中抗菌活性的去除是當(dāng)前驗(yàn)證工作的重點(diǎn),2006年8月,46,供試品中抗菌活性的去除,稀釋法——降低供試品的相對(duì)濃

35、度薄膜法——利用體積差異分離中和法——利用化學(xué)（生物）專屬性滅活離心法——利用沉降系數(shù)差異分離 各方法組合運(yùn)用，會(huì)達(dá)到更好效果！,2006年8月,47,二、驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn),樣品：首先應(yīng)是合格的樣品。本底微生物太多可以先滅活，但不應(yīng)因此影響藥效。注意 針對(duì)抽驗(yàn)品種本底微生物太高情況，如我們沒(méi)條件進(jìn)行滅活處理，可對(duì)檢品適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行驗(yàn)證。（經(jīng)請(qǐng)示專業(yè)委員會(huì)認(rèn)可）,2006年8月,48,檢驗(yàn)量,指供試品一次檢驗(yàn)的用量。一般為10

36、g 或 10ml; 化學(xué)藥膜劑為100cm2。貴重或微量包裝的藥品可酌減（不得少于3g）。檢查沙門(mén)菌的供試品其檢驗(yàn)量改為10g或10ml。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按檢驗(yàn)量執(zhí)行。,2006年8月,49,樣品前處理,制劑形式多樣，決定前處理各異 液體供試品固體、半固體或粘稠液體供試品非水溶性供試品其他,2006年8月,50,液體供試品,取供試品10ml，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為供試液。油劑可先加入適量的無(wú)

37、菌聚山梨酯80使供試品分散均勻，然后再加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml?？扇苄砸后w制劑可用混合的供試品原液作為供試液。,2006年8月,51,固體、半固體或粘稠液體供試品,取供試品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其它有效方法混勻，作為供試液。(常規(guī)方法）必要時(shí)加適量的無(wú)菌聚山梨酯80，并置水浴適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。,2006年8月,52,非水溶性供試品,方法一 2000版

38、已有方法 （乳化法）方法二2005版新增方法 （萃取法）,2006年8月,53,,軟膏、乳膏劑 先將已備妥滅菌的含司盤(pán)80 5g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的混合物融化，待冷至45℃時(shí)，加入供試品5g（或5ml），立即用玻璃棒攪拌均勻，分次少量慢慢加入45℃的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20供試液。,2006年8月,54,,油劑 取供試品10ml，加入無(wú)菌

39、聚山梨酯80 5~8ml，搖勻，再加入pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml。 栓劑 稱取供試品10g，加適量pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，置45℃水浴保溫10min，使溶，加入無(wú)菌聚山梨酯80 5~8ml，振搖使之乳化，再加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，搖勻。,2006年8月,55,,眼膏劑 取供試品10g，加至20ml無(wú)菌十四烷酸異丙酯，必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶

40、解。然后加入pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖5~10min，靜置，待油水明顯分層，取其水層作為供試液。,2006年8月,56,,非水溶性膜劑 化學(xué)藥膜劑一般取樣量為100cm2，置滅菌錐形瓶中，加入適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于45℃水浴保溫，浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。中藥膜劑取50 cm2，剪碎，加入適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（通常1 cm2加1ml或2ml），浸泡，振

41、搖，以供試品浸液作為供試液。,2006年8月,57,腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品,取供試品10g，腸溶制劑加pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml，結(jié)腸溶制劑加pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml，置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為供試液。,2006年8月,58,氣霧劑、噴霧劑供試品,取規(guī)定量供試品，置冰箱冰凍室內(nèi)約1h，取出，速消毒供試品容器的開(kāi)啟部位周圍，用無(wú)菌鋼錐在容器上消毒部位鉆一小孔，在室溫輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)

42、菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無(wú)菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1：10的供試液。,2006年8月,59,茶劑,取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖2～3min，以滅菌紗布過(guò)濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1：10加稀釋劑，浸泡30min）。,2006年8月,60,注意：,以上供試品如吸水膨脹，或黏度過(guò)高，

43、可增加稀釋級(jí)的量，制成1：20～1：100供試液制備供試液所用的乳化劑、分散劑、中和劑及其用量應(yīng)驗(yàn)證，在該檢驗(yàn)條件無(wú)抗菌作用。目標(biāo)是使不便于取樣的供試品分散均勻！,2006年8月,61,計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證定量——回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),在建立供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對(duì)檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)做規(guī)定菌的回收試驗(yàn)，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實(shí)驗(yàn)方法。,2006年8月,62,驗(yàn)證用

44、菌株,細(xì)菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證用菌株： 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 白色念珠菌、黑曲霉取培養(yǎng)物用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成含 50～100cfu/ml的菌液。,2006年8月,63,要求,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)應(yīng)獨(dú)立平行進(jìn)行3次，分別計(jì)算各次試驗(yàn)菌的回收率。,2006年8月,64,具體方法,1)試驗(yàn)組2)菌液組3)稀釋劑對(duì)照組4)供試品對(duì)照組,2006年8月,65,1.試驗(yàn)組,平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能

45、用的最低稀釋級(jí)供試液1ml和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，應(yīng)在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。,2006年8月,66,2.菌液組,測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù),2006年8月,67,3.稀釋劑對(duì)照組,若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊

46、處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。,2006年8月,68,4.供試品對(duì)照組,取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。,2006年8月,69,回收率的計(jì)算,試驗(yàn)組的菌回收率 稀釋劑對(duì)照組的菌回收率,,2006年8月,70,結(jié)果判斷指標(biāo),

47、在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)均不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，按此該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。,2006年8月,71,常規(guī)法,供試液的常規(guī)制備方法： 10g(ml)樣品加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

48、至100ml, 制成1：10供試液,2006年8月,72,常規(guī)菌落計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證過(guò)程,試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml和菌液1ml （50～100cfu試驗(yàn)菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。,2006年8月,73,,菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。供試品對(duì)照組：取1：10供試液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備

49、2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。,2006年8月,74,結(jié)果判斷,計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率，若三次平行試驗(yàn)各個(gè)試驗(yàn)菌的回收率均不低于70%，按常規(guī)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。,2006年8月,75,培養(yǎng)基稀釋法,取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不

50、具抑菌作用。1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿。培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的制劑。,2006年8月,76,,在采用培養(yǎng)基稀釋法時(shí)，應(yīng)注意避免在注皿前菌液和供試液直接接觸實(shí)驗(yàn)組（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均應(yīng)加1ml菌液。,2006年8月,77,以1ml供試液平均分注5個(gè)平皿的方法為例說(shuō)明培養(yǎng)基稀釋法方法驗(yàn)證的過(guò)程,10g(ml)樣品加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml, 制成1：10供試液供試液制備方法為

51、常規(guī)法，無(wú)需進(jìn)行稀釋劑對(duì)照組的實(shí)驗(yàn),2006年8月,78,試驗(yàn)組：1ml 1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共10皿，每皿各加1ml 菌液。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（A）供試品組（本底組）：1ml 1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共10皿。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（B）菌液組：每皿加入1ml菌液，平行2皿。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（C）回收率：（A-B）/C*100％,2006年8月,79,結(jié)果判斷：,計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率，若三次平行試

52、驗(yàn)各個(gè)試驗(yàn)菌的回收率均不低于70%，按培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定供試品的細(xì)菌數(shù)（或霉菌及酵母菌數(shù)）。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用其他方法，如薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。,2006年8月,80,離心沉淀集菌法,1：10供試液的制備：10g樣品加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，低速離心（500rpm離5分鐘）去渣，取上清10ml高速離心（3000rpm離20分鐘）

53、，離心后不要震搖離心管（一般用10 ml帶有刻度的離心管），用注射器或吸管（注意不要插到2ml刻度以下）吸取上面的8 ml棄去，再加 8  ml稀釋液補(bǔ)充到10 ml，混勻。,2006年8月,81,,試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml和菌液1ml （50～100cfu試驗(yàn)菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平

54、行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。供試品對(duì)照組：取1：10供試液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。,2006年8月,82,稀釋劑對(duì)照組：,取含菌稀釋液（含菌濃度為50～100cfu /ml）代替供試品，經(jīng)過(guò)低速離心后轉(zhuǎn)移含菌稀釋液至另一離心管中，高速離心后，用與制備供試液相同的方法吸取離心管上層8ml液體，再加 8  ml稀釋液補(bǔ)充到10 ml，混勻。取此液體1ml注入平皿中

55、，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。 要保證稀釋劑對(duì)照組的操作過(guò)程與實(shí)驗(yàn)組完全相同！,2006年8月,83,不建議使用離心沉淀集菌法,操作過(guò)程不小心極易造成菌體損失，使回收率降低。某些沉降系數(shù)低的細(xì)菌可能被漏檢，而驗(yàn)證試驗(yàn)無(wú)法對(duì)其驗(yàn)證。對(duì)某些抑菌性不強(qiáng)的樣品建議采用培養(yǎng)基稀釋法。,2006年8月,84,薄膜過(guò)濾法,供試品對(duì)照組：取規(guī)定量供試品，相當(dāng)于供試品1g或1ml，如1：10供試液取10

56、ml, 過(guò)濾，沖洗（確定沖洗量），取出濾膜，菌液面朝上貼在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基上，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。試驗(yàn)組：過(guò)濾量，沖洗量同供試品對(duì)照組，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。,2006年8月,85,,菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組：稀釋液+1ml菌液混勻，過(guò)濾，沖洗（沖洗量及沖洗方法同試驗(yàn)組） ，取出濾膜，按薄膜過(guò)

57、濾法測(cè)定其菌數(shù)。,2006年8月,86,注意：,如回收率仍達(dá)不到70%，首先考慮增加沖洗量，少量多次沖洗，不局限于藥典所說(shuō)的每次沖洗100ml。可將待過(guò)濾的樣品稀釋至大量稀釋液中（如: 500ml, 多少量需在驗(yàn)證資料中注明）再進(jìn)行過(guò)濾，這樣可以減少膜對(duì)樣品抑菌成分的吸附。沖洗速度不易過(guò)快，沖洗量不易過(guò)大?？膳c離心沉淀集菌法，中和法等方法聯(lián)用。,2006年8月,87,其他消除抑菌效果的方法,β-內(nèi)酰胺類抗生素 β-內(nèi)酰胺酶

58、奎諾酮類抗生素 0.1mol/L MnSO4,2006年8月,88,,當(dāng)最低稀釋級(jí)的供試液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后試驗(yàn)菌的回收率還無(wú)法達(dá)到計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的要求時(shí)，根據(jù)供試品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，可采用高一稀釋級(jí)的供試液重新進(jìn)行回收率的測(cè)定。若試驗(yàn)菌的回收率符合計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的要求，那么，進(jìn)行供試品細(xì)菌計(jì)數(shù)或霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液 （中

59、國(guó)藥典2006 增補(bǔ)本擬增訂內(nèi)容）,2006年8月,89,控制菌檢查方法驗(yàn)證定性——能否生長(zhǎng)、專屬性實(shí)驗(yàn),樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗(yàn)證一般口服制劑驗(yàn)證大腸埃希菌外用制劑驗(yàn)證金葡和銅綠含藥材原粉；含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗(yàn)證,2006年8月,90,試驗(yàn)菌株,按規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株。大腸菌群檢查用大腸埃希菌梭菌檢查用生孢梭菌。菌種的要求：不得超過(guò)5代。菌液制備為10～100cfu

60、/ml。,2006年8月,91,1.試驗(yàn)組,取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。,2006年8月,92,2.陰性菌對(duì)照組,設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗(yàn)組。陰性對(duì)照菌不得檢出。,2006年8月,93,,2006年8月,94,結(jié)果

61、判斷,陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查。試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行,2006年8月,95,總結(jié)一般的驗(yàn)證過(guò)程：,第一步：常規(guī)法第二步：培養(yǎng)基稀釋法第三步：薄膜過(guò)濾法在計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)先用常規(guī)法對(duì)5種實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果某

62、個(gè)或某些菌的回收率達(dá)不到70%，繼續(xù)用它驗(yàn)證下一步的實(shí)驗(yàn)方法。直到它的回收率達(dá)到70%以上。這時(shí)再用5種菌進(jìn)行平行試驗(yàn)。,,,,,,2006年8月,96,關(guān)于驗(yàn)證菌中敏感菌的選擇,相關(guān)文件選擇原則,2006年8月,97,第七屆全國(guó)藥品檢驗(yàn)所抗生素室主任工作會(huì)議暨全國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)研討會(huì)會(huì)議紀(jì)要（微生物檢驗(yàn)部分）,為了進(jìn)一步理順?lè)椒?yàn)證和目前監(jiān)督抽驗(yàn)工作的關(guān)系，討論認(rèn)為應(yīng)對(duì)以建立科學(xué)合理的檢驗(yàn)方法為目的的方法驗(yàn)證試驗(yàn)和對(duì)監(jiān)督抽

63、驗(yàn)工作中所采用抽驗(yàn)方法的有效性的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)加以區(qū)分，具體有如下三點(diǎn)：,2006年8月,98,1. 對(duì)于注冊(cè)檢驗(yàn)，如果沒(méi)有合理的檢驗(yàn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按照藥典要求，通過(guò)完整的驗(yàn)證試驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法及SOP，所建立的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中應(yīng)確定具體的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)菌檢查中的薄膜過(guò)濾法和直接接種法，微生物限度檢查中的平皿法和薄膜過(guò)濾法。標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中應(yīng)有關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)，如無(wú)菌檢查薄膜過(guò)濾法的沖洗條件；微生物限度檢查平皿法的供試品稀釋程度（0.5ml/皿、0

64、.2ml/皿應(yīng)注明）。對(duì)有抗菌作用的樣品應(yīng)通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)確定一株敏感菌株，以供采納該檢驗(yàn)方法時(shí)進(jìn)行方法的確認(rèn)使用。,2006年8月,99,2. 對(duì)注冊(cè)檢驗(yàn)中已有驗(yàn)證資料的方法進(jìn)行復(fù)核時(shí)，應(yīng)根據(jù)企業(yè)提供材料的情況，結(jié)合藥檢所掌握的情況，通過(guò)分析判斷、適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證等，保證驗(yàn)證資料中檢驗(yàn)方法的合理、可靠和科學(xué)。,2006年8月,100,,3. 對(duì)于目前比較突出的已上市品種的監(jiān)督抽驗(yàn)問(wèn)題，原則上應(yīng)向被抽驗(yàn)品種的生產(chǎn)單位索取方法驗(yàn)證資料，如資料中

65、已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽(yáng)性對(duì)照確認(rèn)或調(diào)整檢驗(yàn)方法。如果沒(méi)有及時(shí)獲得驗(yàn)證資料，或者驗(yàn)證資料中沒(méi)有確定敏感菌株，抗生素及抗菌品種可根據(jù)其抗菌譜確立一株敏感菌株進(jìn)行方法確認(rèn)試驗(yàn)，其他品種可從藥典驗(yàn)證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗(yàn)方法，一般細(xì)菌選擇枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌，或其他有可靠依據(jù)的敏感菌株，方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)可和檢驗(yàn)同步進(jìn)行。,2006年8月,101,敏感菌株的選擇原則,首先是個(gè)動(dòng)態(tài)的選擇；目前針對(duì)固定品

66、種尚未有固定或法定的方法；敏感菌株可以是一株菌，也可是兩株或更多；敏感菌株不一定是藥典規(guī)定的驗(yàn)證用菌株；由于新藥生產(chǎn)過(guò)程中的諸多不穩(wěn)定因素，對(duì)于注冊(cè)品種建議按照藥典規(guī)定菌株逐一進(jìn)行驗(yàn)證。,2006年8月,102,針對(duì)抽驗(yàn)品種,如資料中已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽(yáng)性對(duì)照確認(rèn)或調(diào)整檢驗(yàn)方法；可根據(jù)其抗菌譜確立一株敏感菌株進(jìn)行方法確認(rèn)試驗(yàn)；其他品種可從藥典驗(yàn)證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗(yàn)方法；一般細(xì)菌選擇枯草芽孢桿菌或金黃

67、色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌；其他有可靠依據(jù)的敏感菌株，方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)可和檢驗(yàn)同步進(jìn)行。,2006年8月,103,,抗厭氧菌的，應(yīng)選擇生孢梭菌；抗革蘭氏陰性菌的，應(yīng)選擇大腸桿菌；對(duì)無(wú)明顯抗菌活性的中藥品種（包括注射劑），我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)多對(duì)枯草芽孢桿菌較為敏感，而對(duì)霉菌不敏感；建議中藥品種（包括注射劑），細(xì)菌首選擇枯草芽孢桿菌，真菌選擇白色念珠菌。,2006年8月,104,2005版《中國(guó)藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)及方法建立,山東省藥

68、品檢驗(yàn)所2006.８ 濟(jì)南,2006年8月,105,內(nèi)容,細(xì)菌內(nèi)毒素概述細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法建立的指導(dǎo)原則細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立與驗(yàn)證細(xì)菌內(nèi)毒素檢查附：中外藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法收載 及修訂情況,2006年8月,106,細(xì)菌內(nèi)毒素概述 前言 細(xì)菌內(nèi)毒素,,2006年8月,107,一、前言,自20世紀(jì)60年代鱟血凝集機(jī)制的發(fā)現(xiàn)和鱟實(shí)驗(yàn)方法的建立以來(lái)，引起了各國(guó)藥政管理部門(mén)的極大興趣，

69、并使細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在藥品的熱原限量控制中得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。尤其是與家兔熱原法相比，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有勞動(dòng)強(qiáng)度低，實(shí)驗(yàn)成本小等特點(diǎn)，還可以通過(guò)對(duì)原料、活性成分、滅菌水、容器、賦形劑和終產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，對(duì)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控，更明顯的特點(diǎn)是可以定量檢測(cè)藥品生產(chǎn)過(guò)程中可能污染的痕量?jī)?nèi)毒素，并且為區(qū)分干擾作用與內(nèi)毒素污染提供了極為重要的技術(shù)手段。,2006年8月,108,二、細(xì)菌內(nèi)毒素,1 細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系 注射給藥過(guò)