福州溫泉嗜熱菌多樣性及嗜熱菌Geobacillus thermoglucosidasius低溫適應的機制.pdf

1、溫泉是地球上一類重要的熱環(huán)境，其高溫和貧營養(yǎng)環(huán)境中生存著大量的嗜熱微生物。嗜熱菌是一類重要的微生物，在生存機制和應用方面都吸引著越來越多關注。地球上不同地區(qū)溫泉嗜熱菌組成差異很大，對不同地區(qū)溫泉中嗜熱菌多樣性研究有利于加深對該類生態(tài)系統(tǒng)的認識。地芽孢桿菌屬（Geobacillus）是溫泉可培養(yǎng)嗜熱菌中的優(yōu)勢菌，也是堆肥等熱環(huán)境中的常見菌種，但是隨著近年來在常溫和寒冷環(huán)境中不斷分離到Geobacillus屬菌株，這類嗜熱菌適應低溫生存的機

2、制引起人們關注。本論文通過調查福州三處溫泉的嗜熱菌多樣性，發(fā)現(xiàn)Geobacillus屬細菌在溫泉熱環(huán)境中廣泛分布，在此基礎上進一步研究了Geobacillus屬細菌的低溫適應機制。
　　本研究應用Illumina MiSeq平臺檢測福州大湯（DaTang)、湯埕(TangCheng)和雙龍(ShuangLong)三處溫泉水體中的細菌16S rDNA多樣性，顯示三處溫泉中嗜熱菌多樣性豐富，其中豐度較大的嗜熱菌有變形菌門（ Prote

3、obacteria），厚壁菌門（Firmicutes），產水菌門(Aquificae)，硝化螺旋菌門（Nitrospirae），裝甲菌門（Armatimonadetes），棲熱菌門（Thermi），GAL15菌門，酸桿菌門（Acidobacteria），綠菌門（Chlorobi），放線菌門（Actinobacteria），綠彎菌綱（Chloroflexi），OP1菌門，OD1菌門，擬桿菌門（Bacteroidetes）和EM3菌門。不同

4、溫泉之間細菌多樣性差異較大，Pearson相關性分析和RDA分析顯示三處溫泉微生物多樣性的差異與溫泉溫度、Na+、NO2-和Mg2+等水體理化性質有關。對福州地區(qū)三個典型溫泉：大湯溫泉、湯埕溫泉和雙龍溫泉溫泉底泥中的可培養(yǎng)嗜熱菌進行了研究，結果顯示大湯溫泉嗜熱菌的種類多于湯埕，雙龍溫泉嗜熱菌最少。進一步分析發(fā)現(xiàn)三個溫泉嗜熱菌多樣性與pH，堿解氮和有效磷有關，pH越低，堿解氮和有效磷含量越高溫泉中嗜熱菌越豐富。所分離的32株嗜熱菌隸屬于6

5、個不同的屬，其中Geobacillus屬和Anoxybacillus屬菌株為福州溫泉中的優(yōu)勢嗜熱菌菌種。可培養(yǎng)方式和非可培養(yǎng)方式研究對比發(fā)現(xiàn)溫泉中可培養(yǎng)菌只占非常小一部分，堅壁菌門中產芽孢細菌較易培養(yǎng)；棲熱菌，變形菌等嗜熱菌沒有從現(xiàn)有的培養(yǎng)方式中得到純培養(yǎng)物。改善可培養(yǎng)方式或者應用宏基因組學手段有利于進一步挖掘溫泉嗜熱菌基因資源。對分離的一株嗜熱菌Geobacillus sp. CHB1進行了鑒定和基因組測序。該菌生長溫度范圍為47oC

6、~74oC之間，最適生長溫度為60oC。16S rDNA測序發(fā)現(xiàn)該菌與標準菌株Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T同源性最近為99.26％。該菌的G+C含量為49%，與Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T基因組雜交率為75%。但是其與標準菌株Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T在生理生化特征和細胞膜磷脂脂肪

7、酸組成方面又有所不同，判斷該菌株為 Geobacillus thermoglucosidasius種的一個亞種。對Geobacillus sp. CHB1基因組進行測序，該菌株基因組長度為3.22M，編碼4122個開放閱讀框。
　　本研究以Geobacillus sp. CHB1為目標菌株，應用適應性進化技術（Experimental evolution）向低于其最低生長溫度的方向進化，經過6個月的實驗得到了可以在43oC溫度下起

8、始生長的進化菌株。進化菌株生長速度明顯高于初始菌株。進化菌株Ec細胞膜磷脂脂肪酸在低溫下表現(xiàn)出劇烈調整的傾向，iso15:00在45oC低溫生長時相對含量顯著上升，這也從另一個方面證明了進化后的菌株對低溫的適應能力更好。比較蛋白組學發(fā)現(xiàn)進化菌株與核苷酸相關的蛋白表達量上調，而與脂肪酸代謝相關的蛋白表現(xiàn)下調。蛋白組學結果與進化菌株表現(xiàn)出較高的生長速度和較強的脂肪酸調節(jié)能力是相一致的。在前期6個月進化的基礎上，以Ec為出發(fā)菌株又繼續(xù)向更低生

9、長溫度進行了12個月的進化實驗。溫度生長實驗證明，液體培養(yǎng)條件下三個進化群體（F1、F2和F3)都可以在38-39oC之間穩(wěn)定生長傳代，固體平板實驗證明進化群體中挑取的菌株F3可以在39oC溫度條件下生長并形成菌落。這些證明，在Ec的基礎上，經過12個月的進化實驗，該菌的最低生長溫度又下降了至少4oC。對進化群體Ec，F(xiàn)2和F3進行重測序分析，發(fā)現(xiàn)兩個群體有15個共有的突變基因，其中7個基因在兩個群體中突變位置不同，說明這些基因很可能在

10、這個階段適應低溫的過程中起到重要的作用。比較基因組學發(fā)現(xiàn)MFS、DNA聚合酶β亞基、AB水解酶和肽酶等是獨立適應低溫進化的群體共有的突變基因，認為這些基因是與低溫適應有關的潛在基因突變。從F3群體中挑取兩個單菌落重測序，發(fā)現(xiàn)個體基因組中雜合子明顯少于其對應的群體F3，說明在適應低溫進化過程中群體內菌株間積累了大量的不同的突變，這些突變有些還沒有在群體中固定下來。在這個階段Ec適應更低溫度的進化過程中還出現(xiàn)了一些突變體，F(xiàn)3群體中出現(xiàn)了細

11、胞分裂被抑制的長線形菌體，通過比較基因組結果發(fā)現(xiàn)該群體中FtsK基因發(fā)生了倒位突變。這些結果加深了對嗜熱菌適應低溫的機制的理解。過氧化氫酶在獨立進化的群體EA、EB和EC均表現(xiàn)出比初始菌株A高出20倍以上的過氧化氫酶活性。質譜鑒定證明起作用的過氧化氫酶是一種攜帶血紅素的單功能過氧化氫酶，針對該基因的qPCR進一步證明其在進化菌株中高表達。進化菌株的發(fā)酵液和重組過氧化氫酶都顯示出該過氧化氫酶在0℃~40℃溫度范圍內至少有40%以上的活性，