westernblot(免疫印跡法)

1、WesternBlot(免疫印跡法免疫印跡法)主要包括以下主要包括以下4個基本步個基本步驟：?樣品制備?電泳分離?蛋白的膜轉(zhuǎn)移?免疫雜交與顯色――蛋白檢測溶液和溶液和試劑試劑?1X磷酸鹽緩沖液(PBS)?ModifiedRIPAbufferTrisHCl:50mMpH7.4NP40:1%Nadeoxycholate:0.25%NaCl:150mMEDTA:1mMPMSF:1mMAprotininleupeptinpepstatin:1m

2、icrogrammleachNa3VO4:1mMNaF:1mM?1XSDS樣品緩沖液62.5mMTrisHCl(pH6.8于25C)2%wvSDS10%甘油50mMDTT0.01%wv溴酚藍?轉(zhuǎn)移緩沖液25mMTrisbase0.2M甘氨酸20%甲醇(pH8.3)?10XTris緩沖鹽(TBS)準備1L10XTBS:24.2gTrisbase80gNaCl用1NHCl調(diào)pH為7.6?脫脂奶粉或BSA?甲醇?TBST緩沖液1XTBS0.1

3、%Tween20?封閉緩沖液（TBST）1XTBS0.1%Tween20加5%wv脫脂奶粉或BSA?一抗的稀釋1XTBS0.1%Tween20加5%BSA(多抗)或5%脫脂奶粉(單抗)Note:一般來說BSA被推薦用于多克隆抗體，脫脂奶粉用于單克隆抗體，這樣可得到較高的信噪比?？贵w的稀釋度參考抗體說明書或根據(jù)實驗確定。?預染的蛋白質(zhì)Marker，可用于監(jiān)測轉(zhuǎn)膜的效率樣品制品制備原始樣品可為細胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，

4、以下為定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。2.依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和35秒鐘。3.裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿?3層濾紙?膠?膜?3層濾紙?海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記：膠放于：膠放于負極面（黑色面）。極面（黑色面）。4.將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5、注意：注意：應再次再次檢查檢查三明治和三明治和電極是否裝配極是否裝配正確，正確，電源是否接通。源是否接通。5.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜white()black()spongespongewhatmanwhatmangelfilter免疫免疫雜交與交與顯色1用25mlTBS洗膜5min，室溫，搖動。2置膜于25ml封閉緩沖液中1h室溫，搖動。315mlTBST洗3次（5minT）。4加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育12h或4C過夜，

6、緩慢搖動。515mlTBST洗3次（5minT）。6加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。715mlTBST洗3次（5minT）。815mlTBS洗1次。9蛋白檢測(顯色法或發(fā)光法，按相應試劑說明操作)。注意事注意事項：1操作中戴手套，不要用手觸膜。2PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒。3如檢測小于20kD的蛋白應用0.2m的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平衡步驟。4某些抗原和抗體可被T