基于直接藍(lán)71免洗脫染色的蛋白質(zhì)免疫印跡內(nèi)參方法學(xué)研究.pdf

1、研究背景：
　　近30年來，蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting)一直作為一項(xiàng)常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。其包括凝膠電泳分離，及后續(xù)的免疫檢測兩個(gè)主要步驟。
　　Western Blotting主要用于蛋白質(zhì)定性和半定量分析，即檢測樣品中目標(biāo)蛋白的有無、或不同樣品中目的蛋白的差異表達(dá)水平。在定性分析中，需首先檢測泳道中是否存在蛋白，以排除系統(tǒng)非正常工作所導(dǎo)致的假陰性;而半定量分析時(shí)，則需要校正不

2、同樣品的上樣量以及轉(zhuǎn)印效率的差別造成的系統(tǒng)誤差。為此，實(shí)驗(yàn)過程中往往需要引入合適內(nèi)參(loading control)來作為體系對照。目前使用的內(nèi)參主要有兩種趨勢，一種是采用傳統(tǒng)的管家基因所表達(dá)的蛋白即管家蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)，將其發(fā)光灰度值作為體系內(nèi)參;另一種則是采用全蛋白染色法，即將全部上樣蛋白染色后的灰度值作為體系內(nèi)參。
　　直接藍(lán)71(Direct Blue71，DB71)是一種工業(yè)常用的偶氮染料，2000年Hee-Youn

3、Hong首次發(fā)現(xiàn)該染料在酸性環(huán)境下能進(jìn)行蛋白染色，并且在弱堿性環(huán)境下易于洗脫。那么，DB71染色是否能作為一種Western Blotting內(nèi)參，這種染色方法是否會影響后續(xù)的免疫反應(yīng)，其在天然樣本中的染色范圍與線性程度等，這些問題均需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過與傳統(tǒng)的單一蛋白免疫內(nèi)參和全蛋白染色內(nèi)參進(jìn)行比較，建立基于直接藍(lán)71免洗脫染色的蛋白質(zhì)免疫印跡內(nèi)參。
　　方法：
　　采用三種常見的神經(jīng)

4、科學(xué)研究樣本（人血漿，人少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞，大鼠腦組織）系統(tǒng)評估DB71染色法作為Western Blotingt內(nèi)參的可行性。其中，考馬斯亮藍(lán)作為傳統(tǒng)的全蛋白膜染色內(nèi)參法，β-tubulin作為傳統(tǒng)的蛋白印記免疫內(nèi)參法，維他命D結(jié)合蛋白作為日常實(shí)驗(yàn)中的目的蛋白來與DB71染色法進(jìn)行對照試驗(yàn)。每種樣本重復(fù)上樣6次，采用相關(guān)系數(shù)評估其精確性;2.5-40μg的線性蛋白上樣，采用R2來評估方法的線性及線性范圍;共3次技術(shù)重復(fù)，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)

5、來評估DB71染色法與兩組對照內(nèi)參法的差異和可重復(fù)性。
　　結(jié)果：
　　(1)在少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞組中，DB71染色法的精確性和可重復(fù)性較考馬斯亮藍(lán)膜染色內(nèi)參法有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而大鼠腦組織和人血漿組并未表現(xiàn)明顯差異。
　　(2)在少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞組和大鼠腦組織組中，直接藍(lán)71染色法的精確性性和可重復(fù)性較β-tubulin免疫內(nèi)參法有明顯優(yōu)勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3)在少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞組和大鼠腦組織組中，未洗脫的直接藍(lán)

6、71染色法的精確性和可重復(fù)性較未染色的β-tubulin組和維他命D結(jié)合蛋白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果表明未洗脫的直接藍(lán)71對后續(xù)的免疫反應(yīng)不會造成太大干擾。
　　(4)在三組樣本的2.5-40μg上樣范圍內(nèi)，直接藍(lán)71染色法線性好，與考馬斯亮藍(lán)染膜法和β-tubulin免疫內(nèi)參法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在血漿樣本中，直接藍(lán)71染色法較維他命D結(jié)合蛋白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而維他命D結(jié)合蛋白組線性較差，推測其可能在20μg已達(dá)到免疫線性上限。