共聚焦顯微鏡原理

1、激光共聚焦顯微鏡的構件與原理激光共聚焦顯微鏡的構件與原理一、主要構件一、主要構件：一個完整的激光掃描共聚焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM)系統(tǒng)由幾個主要的硬件和一些成像分析軟件組成。硬件包括表面熒光顯微鏡、激光光源及冷卻系統(tǒng)、定位掃描裝置、分辨系統(tǒng)、計算機控制系統(tǒng)、顯示器和圖像輸出打印設備，軟件由三維圖像分析系統(tǒng)和三維圖像文件管理系統(tǒng)構成。1、Illuminatingpinhole:照明

2、針孔功能:使激光經(jīng)過照明針孔后形成點光源，點光源具有光源方向性強、發(fā)散小、亮度高、高度的空間和時間相干性以及平面偏振激發(fā)等獨特的優(yōu)點。且與detectpinhole(探測器針孔)及焦平面形成共聚焦裝置。2、Objective:物鏡3、Focalplane:焦平面功能:激光點光源照射物體在焦平面處聚焦，激發(fā)熒光標記的樣本發(fā)射熒光，形成焦點光斑。該光斑經(jīng)過objective、beamsplitter等一系列裝置的處理，分別在illumina

3、tingpinhole及detectpinhole兩處聚焦。共聚焦的含義由此而來。4、Detectpinhole:探測器針孔功能:與beamsplitter作用類似，起到空間濾波器的作用。最大限度的阻礙非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦點斑以外的散射光以保證探測器針孔所接受到的熒光信號全部來自于樣品光斑焦點位置，因此樣品上衍射聚集光斑和探測器針孔成像光斑包含相同信息（兩點共軛）。5、PMT：光電倍增管（探測器）功能:接受通過針孔的光信號，

4、轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杺鬏斨劣嬎銠C，在屏幕上出現(xiàn)清晰的整幅焦平面的圖象。6、激光器我們可以根據(jù)研究需要選擇不同的激光器。ArUV(351、364nm)，AR(457、488、514nm)，HeNe(543、633nm)等二、基本原理：二、基本原理：傳統(tǒng)的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡一、基本原理：一、基本原理：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長（能量?。┑墓庾?，在經(jīng)過一個很

5、短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量。Figure2.PrinciplesofTwoPhotonExcitation二、特點：二、特點：1、物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不

6、需要共聚焦針孔，從而大大提高成像亮度和信噪比；2、長波長的光比短波長的光受散射影響較小容易穿透標本；3、焦平面外的熒光分子不被激發(fā)使較多的激發(fā)光可以到達焦平面（焦平面的熒光分子不被雙光子激發(fā)），使激發(fā)光以穿透更深的標本，軸向分辨率更高；4、長波長的近紅外光比短波長的光對細胞毒性?。?、使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性?？傊?，雙光子顯微鏡比單光子顯微鏡更適合用來觀察厚標本、更適合用來觀察活細胞、或用來進行定