分子標記技術

1、分子標記技術分子標記技術摘要：摘要：分子標記技術就是利用現(xiàn)代分子生物學基礎分析DNA分子特性，并借助一些統(tǒng)計工具，將不同物種或同一物種的不同類群區(qū)分開來，或者將生物體的某些性狀與DNA分子特性建立起來的關聯(lián)關系，已廣泛應用于植物遺傳與育種研究的眾多領域，包括遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性分析、物種起源與進化、品種資源與純度鑒定、分子輔助育種等多個方面，具有重大作用。關鍵詞：關鍵詞：分子標記技術原理RFLPRAPDSSRAFLPESTSNPT

2、RAP分子標記技術應用引言引言分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記——形態(tài)學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優(yōu)越性有：大多數分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達，

3、與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA分子標記技術已有數十種，廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。一常用分子標記原理一常用分子標記原理分子標記技術的種類根據不同的核心技術基礎，DNA分子標記技術大致可分為三類:第一類以Southern雜交為核心其代表性技術為RFLP；第二類以PCR技術為核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第

4、三類以DNA序列(mRNA或單核苷酸多態(tài)性)為核心，其代表性技術為EST標記、SNP標記等。理想的分子標記應達到以下的要求：①具有高的多態(tài)性；②共顯性遺傳；③能夠明確辨別等位基因；④分布于整個基因組中；⑤選擇中性(即無基因多效性)；⑥檢測手段簡單、快速；⑦開發(fā)成本和使用成本盡量低廉；⑧在實驗室內和實驗室間重復性好。目前，沒有任何一種分子標記均滿足以上的要求，它們均具有各自的優(yōu)點和不足。其特點比較見表一。1限制性內切酶片段長度多態(tài)性標記（

5、限制性內切酶片段長度多態(tài)性標記（RestrictionRestrictionFragmentFragmentLengthLengthPolymphismPolymphism，RFLPRFLP）1974年，Grozdicker等人鑒定溫度敏感表型的腺病毒DNA突變體時，發(fā)現(xiàn)了經限制性內切酶酶解后得到的DNA片段產生了差異，由此首創(chuàng)了第一代DNA分子標記技術——限制性內切酶片段長度多態(tài)性標記(RFLP)。其原理是由于不同個體基因型中內切酶位

6、點序列不同(可能由堿基插入、缺失、重組或突變等造成)，利用限制性內切酶酶解基因組DNA時，會產生長度不同的DNA酶切片Repeat，STR)。真核生物基因組中存在大量重復頻率極高而順序復雜性極低的串聯(lián)重復序列[5]。按重復基序的長度可將串聯(lián)重復序列分為衛(wèi)星DNA（基序100300bp）、小衛(wèi)星DNA（基序1060bp）、微衛(wèi)星DNA（基序16bp）。和中衛(wèi)星DNA（由不同大小串聯(lián)重復組成）等。微衛(wèi)星是由DNA復制或修復過程中DNA滑動和

7、錯配或者有絲分裂、減數分裂期姐妹染色單體不均等交換引起的。微衛(wèi)星的突變率在不同物種、同一物種的不同位點或同一位點的不同等位基因間存在很大差異。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，根據這兩端的序列設計一對特異引物，通過PCR技術將期間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴增出來，利用電泳分析技術就可以得到其長度的多態(tài)性，此即SSR標記的原理。SSR標記具有高度重復性、豐富的多態(tài)性、共顯性、高度可靠性等優(yōu)點，但由

8、于其需要對所研究物種的一系列微衛(wèi)星位點進行克隆和測序分析，以便設計相應的引物，這是非常費時、費力和代價昂貴的工作，沒有足夠的投資、人力和時間，是不可能實現(xiàn)的，因而給它的利用帶來了一定困難。簡單重復序列間區(qū)標記(InterSimpleSequenceRepeat，ISSR)可以克服以上提到的SSR標記的缺點，或稱錨定簡單重復序列標記(AnchedSimpleSequenceRepeat，ASSR)。在SSR序列的3’端或5’端加上一個24

9、bp的隨機核苷酸，形成微衛(wèi)星DNA的錨定引物，在PCR反應中，錨定引物可引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA片段進行擴增。所擴增的interSSR區(qū)域的多個條帶通過電泳可分辨，呈現(xiàn)出擴增帶的多態(tài)性。該方法不需知道DNA序列即可用錨定引物擴增。4擴增片段長度多態(tài)性標記擴增片段長度多態(tài)性標記(Amplified(AmplifiedFragmentFragmentLengthLengthPolymphismPol

10、ymphism，AFLP)AFLP)1993年，荷蘭科學家Zbaeau和Vos發(fā)現(xiàn)了一種檢測DNA多態(tài)性的新方法，即擴增片段長度多態(tài)性標記(AFLP)。AFLP是RFLP與PCR相結合的產物，其原理是先用兩種限制性內切酶(低頻剪切酶和高頻剪切酶，前者識別為點為6bp，后者為4bp)雙酶切基因組DNA產生不同大小的DNA片段，酶切產物玉雙鏈人工接頭連接，作為擴增反應的模板DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最后在接頭互補鏈的基

11、礎上添加13bp選擇性核苷酸作引物對模板DNA再進行選擇性擴增，電泳分離獲得的DNA擴增片段，根據擴增片段長度的不同檢測出多態(tài)性。引物由三部分組成：與人工接頭互補的核心堿基序列、限制性內切酶識別位點序列、引物3’端的選擇堿基序列(110bp)。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個堿基序列為結合位點。該技術的獨特之處在于所用的專用引物在不知道DNA信息的前提下就可對酶切片段進行PCR擴增。AFLP結合了RFLP和RAPD兩種技術的優(yōu)勢，具有分辨

12、率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點。但它的技術費用昂貴，對DNA的純度和內切酶的質量要求很高。盡管AFLP技術誕生時間較短，但可稱之為分子標記技術的又一次重大突破，被認為是目前一種十分理想、有效的分子標記。5表達序列標簽標記（表達序列標簽標記（ExpressedExpressedSequenceSequenceTagTag，ESTEST）1991年，Adams等人用EST對表達序列進行了研究，他們從人腦cDNA文庫中隨機挑取600個克隆，測序