分子標(biāo)記技術(shù)在草魚個體識別中可行性探究.pdf

1、本研究采用基于COI基因的DNA條形碼技術(shù)和微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)對草魚個體識別進(jìn)行研究，為后續(xù)草魚育種養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。
　　傳統(tǒng)酚-氯仿法是提取DNA的一種常用方法。該法的優(yōu)勢是DNA提取量大，但質(zhì)量偏低，且傳統(tǒng)法提取DNA通常選取樣本肌肉或血液，對樣本傷害極大。本研究在傳統(tǒng)酚-氯仿法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，結(jié)合Tris飽和酚不含醌等氧化物、Chelex100法提取DNA時間短的優(yōu)勢，優(yōu)化獲得一種以魚鱗為原材料的，改良DNA提取法。此法所

2、提取DNA效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)法，并通過PCR實(shí)驗(yàn)顯示，所提取的核基因和線粒體基因都可用于后續(xù)各類研究。
　　COI又稱細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(cytochrome c oxidase subunit I)，COI基因(cytochrome oxidase I)即為線粒體DNA上編碼該亞基的基因，長度大約600bp，主要用于物種鑒定或生物系統(tǒng)發(fā)育研究。通過使用Dnaman等生物軟件，對草魚COI基因序列比對分析，了解草魚COI基因之間

3、相互關(guān)系，進(jìn)一步探討基于COI基因的DNA條形碼技術(shù)在草魚個體識別方面的可行性。結(jié)果顯示，草魚COI基因片段大小約為1440bp，堿基T、A、C、G的平均含量分別為30.2％、27.1%、25.0%，17.7%呈依次遞減趨勢，其中G的含量明顯低于其它的含量，表現(xiàn)出很強(qiáng)的堿基組成偏向性。9尾草魚COI基因序列共有24處堿基突變，在序列第280-440bp之間和第1300-1410bp之間分別有7個和6個突變位點(diǎn)，屬于突變頻率較高區(qū)段，可考

4、慮作為DNA微型條形碼。各草魚之間的遺傳距離為0.1-0.6%，平均遺傳距離0.39%，小于同一物種內(nèi)遺傳距離的臨界值2%，因此線粒體COI基因作為DNA條形碼技術(shù)目的基因，不適用于草魚的個體識別。
　　微衛(wèi)星又稱簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)，存在于絕大多數(shù)真核生物的基因組中。利用微衛(wèi)星突變率高、中性DNA、存在廣泛且序列兩端的保守性較好等特點(diǎn)，微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛運(yùn)用于各種生物領(lǐng)域。

5、本研究利用該技術(shù)將少量多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星位點(diǎn)排列組合，從85對微衛(wèi)星引物進(jìn)行篩選出8對多態(tài)性較好的引物(HLJC115、HLJC104、HLJC107、13118、HLJC2、HLJC111、HLJC9和HLJC126)，分別用于11尾草魚樣本和63尾草魚樣本的個體識別，11尾草魚樣本共擴(kuò)增出19對等位基因，平均每個位點(diǎn)含4.75對等位基因，等位基因數(shù)目范圍2-7之間。63尾草魚樣本共擴(kuò)增出38對等位基因，平均每個位點(diǎn)含6.33對等位基