基因工程筆記

1、基因工程課程筆記創(chuàng)建于2014.10.31第1頁共35頁緒論緒論第一節(jié)基因工程的誕生第二節(jié)基因工程的安全性第三節(jié)基因工程的應用第四節(jié)基因工程技術(shù)的商業(yè)化發(fā)展一、定義※GeicGeicengineeringengineering：?在體外將核酸分子?插入病毒質(zhì)?；蚱渌d體系統(tǒng)中構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合?再整合到那些本來不含該類物質(zhì)的宿主中?從而形成一種新的可連續(xù)繁殖的有機體＆就是有意識地把一個生物體中有用的目的基因轉(zhuǎn)入另一個生物體中，使后者獲

2、得新的遺傳性狀或表達所需要的產(chǎn)物?！鵆lone:從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細胞或個體所組成的特殊的生命群體。二、特征特征1.跨物種性外源基因到另一種不同的生物細胞內(nèi)進行繁殖。2.無性擴增外源DNA在寄主細胞內(nèi)可大量擴增，和高水平表達。三、基因工程的主要操作內(nèi)容三、基因工程的主要操作內(nèi)容（供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件）1.目的基因的獲取：從復雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，

3、分離出帶有目的基因的DNA片斷。片斷。2.重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記（抗菌素抗性）的載體分子上。3.重組體的轉(zhuǎn)化將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當?shù)氖荏w細胞中。4.克隆鑒定:挑選轉(zhuǎn)化成功的細胞克?。ê心康幕颍?.目的基因表達:使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產(chǎn)物。安全性安全性一、基因工程的安全措施（1）實驗室的物理安全）實驗室的物理安全①P1級實驗室一般裝備良好的普通微生物實驗室。②P2

4、級實驗室在P1級實驗室的基礎上還裝備有負壓的安全操作柜?；蚬こ陶n程筆記創(chuàng)建于2014.10.31第3頁共35頁染色體線性染色體線性DNADNA和或有缺口的質(zhì)粒和或有缺口的質(zhì)粒DNADNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結(jié)變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDSSDS復合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。復合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。所用的試劑作用所用的試劑作用①溶菌酶能水解菌體細胞壁的主要

5、化學成分肽聚糖中的?1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH8）下有活性②葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解③EDTAMg2、Ca2的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOHSDSNaOH：強堿，提供pH12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:溶解細胞膜蛋白和細胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。⑤NaAcHAc緩沖液冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4

6、.8。用來中和NaOH變性液，使DNA復性，高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀⑥乙醇用于沉淀DNA，DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液：DNA保存液。由TrisHCl和EDTA配制TrisHCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解

7、⑨酚氯仿（選用選用）蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會殘留在DNA溶液中。提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNADNA的步驟的步驟溶菌溶菌破膜破膜蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)和DNADNA變性變性中和中和離心除去沉淀離心除去沉淀純化純化DNADNA沉淀沉淀DNADNA溶菌：使用溶菌：使用“溶液Ⅰ溶液Ⅰ”溶解細菌細胞壁。溶解細菌細胞壁。溶液Ⅰ：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTrisHCl(pH8.0)，10mMEDTA，45mgml溶

8、菌酶，RNaseA溶液溶液IIII0.2NNaOH，1.0%SDS溶液溶液IIIIII3M醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）影響質(zhì)粒影響質(zhì)粒DNADNA產(chǎn)量的因素產(chǎn)量的因素◆菌株的遺傳背景，◆質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)DNADNA的定量和純度測定的定量和純度測定1.紫外光譜法（DNA（或RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰。蛋白質(zhì)280）2.瓊脂糖凝膠電泳估計（溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)紅色熒光與已知濃度的DNA電