速凍面米制品中金黃色葡萄球菌的快速定量檢測及分型.pdf

1、本研究從市售速凍面米制品中按照國標方法（GB4789.10-2010）進行金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的分離及鑒定，同時用PCR方法進行驗證；在不進行前增菌的情況下，比較了四種基因組DNA提取方法（CTAB法、離心柱法、羧基化納米磁珠法和氨基化納米磁珠法）從速凍面米制品中直接提取金黃色葡萄球菌 DNA的效率和純度；將磁珠分離與TaqMan Real-time PCR結合，建立了快速定量檢測金黃色葡萄球菌污

2、染水平的方法；針對速凍面米制品中的金黃色葡萄球菌分離株，使用PCR方法對其中腸毒素基因的分布多樣性進行了篩查，并結合多位點序列分型（MLST），探討了各基因型毒力因子的分布規(guī)律。
　　本研究的主要內容如下：
　　（1）共采集速凍面米制品樣品（肉餡類、素餡類和無餡類）288份，按照國家標準進行金黃色葡萄球菌的分離和鑒定，并PCR擴增nuc1基因進行確證。結果有88份樣品檢出了金黃色葡萄球菌，陽性檢出率達到了30.56%，其中肉

3、餡類速凍面米制品中檢出率為41.44%，高于其他兩類；從88份陽性樣品中一共獲得了124株金黃色葡萄球菌分離株。
　　（2）對CTAB法、離心柱法、羧基化納米磁珠法和氨基化納米磁珠法等四種DNA提取方法進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)氨基化納米磁珠法在提取DNA的效率和純度方面表現(xiàn)最佳，在不進行增菌的情況下可直接從速凍面米制品中提取金黃色葡萄球菌 DNA，有效消除蛋白質、脂質等雜質，并且在1.5 h內即可完成DNA的提取。
　?。?）氨

4、基化納米磁珠分離法與TaqMan探針法Real-time PCR結合使用可實現(xiàn)快速定量檢測，4h內即能得到最終結果，大大降低檢測時間。使用該方法在32份陽性樣品中進行驗證，得到的結果與國標方法BP平板計數(shù)結果沒有顯著性差異（p>0.05），該方法準確度較高。
　　（4）使用建立的快速定量檢測方法和國標法對陽性樣品進行定量測定，結果顯示肉餡類樣品中金黃色葡萄球菌污染量最高，達到了2.00×103~1.21×105 CFU/g，素餡類

5、中為7.88×102~7.89×103 CFU/g，無餡類中為4.68×102~5.60×103 CFU/g，88份陽性樣品中有6份肉餡類樣品超過了新國標規(guī)定的最大允許檢出量（104 CFU/g）。
　　（5）對得到的124株金黃色葡萄球菌分離株進行了PCR擴增，篩查了18種腸毒素基因（sea-see，seg-ser，seu）的分布情況。結果顯示：高達89.52%（111/124）的食源性分離株都攜帶有腸毒素基因；最多攜帶10種腸

6、毒素基因的有5株；僅有13株菌不含所檢測的18種腸毒素基因；18種腸毒素基因中，檢出率最高的是sep，攜帶率高達44.35%（55/124)，其次是sei（43.55%）和seg（42.74%），這三種基因的攜帶率都超過了40%。
　?。?）對124株金黃色葡萄球菌食源性分離株進行了多位點序列分型（MLST），結果共有36個ST型，其中31個為數(shù)據(jù)庫中已有ST型，5個為新ST型（new-1~new-5）。菌株數(shù)目最多的為ST-7（

7、21.77%，27/124），依次為 ST-1（7.26%，9/124）、ST-5和ST-25（各5.65%，7/124）；ST-9、ST-15、ST-2871、ST-188等也比較常見。36個ST型分布在19個克隆系（CCs）中，CC7是這124株食源性分離株中最流行的克隆系（29.84%，37/124），其次是CC5和CC15（8.87%，11/124）；CC7（ST7、ST306、ST943）和CC239（ST630、ST239、

8、ST3159）是多樣性最大的克隆系，均包含3個不同的ST型。結合腸毒素基因攜帶情況，發(fā)現(xiàn)ST-7型無論是菌株數(shù)量還是攜帶腸毒素基因數(shù)目都是最多的；CC30、CC9、CC72、CC5和CC25平均比其他克隆系攜帶更多腸毒素基因；傳統(tǒng)腸毒素基因基本分布在CC1、CC5、CC25和CC7中。
　　本研究從速凍面米制品中進行了金黃色葡萄球菌的分離鑒定、建立了快速定量檢測方法、篩查了腸毒素基因的分布情況并進行了MLST分型，為快速定量檢測食