布魯桿菌Ⅱ型MEP合酶的制備表征及其催化機制的初步探索研究.pdf

1、背景:隨著抗生素耐藥性問題不斷加劇，對多種疾病可選用的治療辦法正在耗盡，臨床上迫切需要新型抗生素的研究與開發(fā)。類異戊二烯化合物合成過程中的關鍵酶2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)合成酶，又稱1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構化酶(DXR)是最有前景的抗生素篩選靶標之一。以DXR為靶點篩選的抗生素膦胺霉素具有用于治療由多重耐藥菌和惡性瘧原蟲(Plasmodium)引起的感染的潛力。最新的研究發(fā)現一些主要致病菌如巴爾通體屬（Ba

2、rtonella）和布魯桿菌屬（Brucella）的菌體內不存在DXR蛋白，而是被一種DRL酶(DXR-like，或稱Ⅱ型DXR)所替代。雖然DRL與DXR的功能相同，但是兩者無論是在系統(tǒng)發(fā)生樹還是在晶體結構上都具有明顯的差異。因此有可能針對BaDRL篩選一批抗菌譜窄、特異性強的抗菌化合物。
　　內容:本文首先成功構建了E.coli BL21(DE3)-BaDRL工程菌株，對其進行誘導表達布魯桿菌源BaDRL。使用常規(guī)IPTG誘導

3、時，BaDRL表現出菌體產量低，酶活性不高等問題;通過進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，使用自誘導方式培養(yǎng)不僅解決了菌體產量低的情況而且獲得的酶活力大大增強。其次，以葡萄糖為原料模擬體內糖酵解途徑，采用“一鍋法”酶法合成了純度較高的DRL底物DXP，用于研究BaDRL催化機制。最后，利用羰基化合物中的羰基與溶劑H2O交換氧原子這一現象，在H218O中進行DRL催化DXP向MEP轉化的反應，通過分析產物MEP的18O標記位置和相對豐度，推測酶BaDRL