溶藻弧菌噬菌體特性及其防控刺參感染的研究.pdf

1、刺參(Apostichopus japonicus)是我國(guó)北方沿海地區(qū)最具規(guī)模的經(jīng)濟(jì)類海水養(yǎng)殖動(dòng)物，具有極高的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。近年來(lái)，隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模的快速發(fā)展，由弧菌為主要病原菌引發(fā)的腐皮綜合征給刺參養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅2003～2005年，由該病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)20億元，其患病幼參的死亡率高達(dá)90％以上，該病已成為制約刺參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一大難題。研究證明，溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）為引起

2、該病的主要病原菌之一。
　　噬菌體療法是一種利用噬菌體對(duì)目標(biāo)宿主菌的裂解作用，主動(dòng)降低病原菌密度，進(jìn)而減少或者避免病原菌感染或發(fā)病的生物防控技術(shù)?，F(xiàn)有研究表明，水體養(yǎng)殖是噬菌體應(yīng)用的理想環(huán)境，水體介質(zhì)的高流動(dòng)性可提高噬菌體的擴(kuò)散能力，且噬菌體自身具有安全無(wú)毒害、高效低成本和研發(fā)周期短的特點(diǎn)，極其適宜作為一種抗生素替代品應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的病原防控。
　　本研究以刺參致病性溶藻弧菌為宿主，篩選其裂解性噬菌體并考察噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)

3、境中對(duì)溶藻弧菌的防控效果。研究主要工作如下:
　　(1)從患有腐皮癥的病參病灶處分離獲得非溶源性溶藻弧菌一株，經(jīng)驗(yàn)證對(duì)健康刺參具有單一菌株致病性(半數(shù)致死量分別為腹腔注射攻毒9.44×103 CFU/g，浸浴攻毒1.82×106 CFU/mL)，該菌對(duì)氨芐西林和鏈霉素具有耐藥性;分離獲得兩株溶藻弧菌裂解性噬菌體PVA1和PVA2，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察兩株噬菌體都為有尾目噬菌體，PVA1為短尾科噬菌體而PVA2為肌尾科噬菌體;噬菌體PVA1

4、潛伏期為20 min，裂解量為108PFU/cell，噬菌體PVA2的潛伏期約30 min，裂解量為98 PFU/cell;兩株噬菌體均可在12h內(nèi)抑制溶藻弧菌的生長(zhǎng)，且最適pH值在6.0～8.0之間;
　　(2)全基因組測(cè)序結(jié)果顯示噬菌體PVA1基因組為雙鏈線性DNA，全長(zhǎng)41529 bp，GC含量為43.7％并且無(wú)編碼tRNA基因的存在;預(yù)測(cè)出75個(gè)開(kāi)放閱讀框，占全基因組93.32％;預(yù)測(cè)出推定功能基因21個(gè)，可將噬菌體基因組

5、分為結(jié)構(gòu)基因、DNA包裝、DNA復(fù)制和調(diào)控及其他功能基因共四部分;未發(fā)現(xiàn)與噬菌體PVA1基因組具有同源性的其他噬菌體;
　　(3)對(duì)噬菌體PVA1中內(nèi)溶素推定基因gp60進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)蛋白大小為171aa，分子量19.41 kDa，并在6～94位存在一個(gè)糖基水解酶的活性域，在58～159位存在一個(gè)肽聚糖結(jié)合域，為典型的革蘭氏陽(yáng)性菌噬菌體內(nèi)溶素的功能域結(jié)構(gòu)布局;將gp60內(nèi)溶素基因進(jìn)行克隆并原核表達(dá)，結(jié)果顯示重組

6、內(nèi)溶素為部分可溶性表達(dá)，分子量小于20 kDa;使用濁度法檢測(cè)重組內(nèi)溶素對(duì)經(jīng)EDTA處理后的溶藻弧菌的裂解酶活，測(cè)算其酶活為1184±163 U/mg，顯著低于商品化蛋清溶菌酶;
　　(4)利用噬菌體PVA1、PVA2及二者的混合噬菌體制劑對(duì)經(jīng)溶藻弧菌浸浴攻毒的刺參進(jìn)行預(yù)防試驗(yàn)。結(jié)果顯示，施用1.0×107 PFU/mL的混合噬菌體對(duì)刺參保護(hù)效果最佳且與5 mg/L強(qiáng)力霉素試驗(yàn)組無(wú)顯著性差異;不同噬菌體與抗生素對(duì)經(jīng)溶藻弧菌腹腔注射

7、攻毒的刺參治療試驗(yàn)結(jié)果顯示，刺參在經(jīng)腹腔注射攻毒后噬菌體施用的時(shí)間點(diǎn)越早治療效果越好，但各噬菌體組的刺參存活率顯著低于強(qiáng)力霉素試驗(yàn)組;相比于注射溶藻弧菌，向健康刺參腹腔液中注射溶藻弧菌與噬菌體的混合物可顯著減弱溶菌酶、酸性磷酸酶和過(guò)氧化物酶的活性，增強(qiáng)一氧化氮合酶的活性;
　　(5)將噬菌體凍干粉添加至刺參基礎(chǔ)飼料飼喂養(yǎng)殖刺參，經(jīng)60天試驗(yàn)結(jié)果表明，與未添加噬菌體的飼料相比，添加噬菌體PVA1、噬菌體PVA2和二者的混合噬菌體不會(huì)