三株海洋新菌的鑒定及細菌017T和TS1T的瓊膠酶研究.pdf

1、海洋沉積物中蘊藏著非常豐富的微生物資源，富集培養(yǎng)法可有效地分離獲得海洋新型菌株及特殊功能菌株，深入研究海洋功能微生物對于開發(fā)利用海洋資源有著重要的意義。本論文完成了三株海洋新菌的鑒定，一株瓊膠降解細菌的發(fā)酵產酶條件優(yōu)化，兩株瓊膠降解細菌的基因組生物信息學分析，并對6條瓊膠酶基因進行了外源表達與產物分析，重組瓊膠酶Aga2293的純化及其酶學性質研究。
　　已完成三株海洋新菌的鑒定工作，確定菌株FB208T為擬桿菌門、擬桿菌綱、海洋

2、滑動菌科、海絲菌屬的一個新種，命名為微白黃海絲菌，學名為Marinifilumalbidiflavum sp.nov.;確定菌株HF401T為擬桿菌門、擬桿菌綱、海洋滑動菌科、海線菌屬的一個新種，命名為桶色海洋線狀菌，學名為Geofilum rhodophaea sp.nov.;確定菌株TS1T為變形菌門，γ變形菌綱的一個新屬新種，學名為Agarimarinamarina gen.nov.，sp.noV.。建議組建新的科級分類單位，海生

3、瓊膠菌科(Agarimarinaceae、)。
　　通過單因素和響應面優(yōu)化實驗，對本實驗室分離獲得的海洋瓊膠降解細菌Agarilytica rhodophytacola017T進行了發(fā)酵產酶條件優(yōu)化。確定了其最佳發(fā)酵產酶條件:瓊脂粉含量1.5 g/L，鹽度29.6 g/L，溫度33.17℃，胰蛋白胨6g/L，裝瓶量50 mL，接種量為2％，起始pH為6.5，搖床轉速為150 rpm/min，培養(yǎng)時間36 h。在上述條件下，發(fā)酵液的

4、酶活為2.46 U/mL。
　　分別對海洋瓊膠降解細菌TS1T和017T進行了基因組測序:細菌TS1T的基因組不含有質粒，預測含有12條瓊膠酶基因，存在染色體DNA;細菌017T除了染色體DNA外，還含有4個質粒，19條瓊膠酶基因存在于染色體DNA中，3條存在于1號質粒上。對菌株TS1T和017T的6條呵能編碼瓊膠酶的基因進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)aga1766、aga2293、aga2578、aga1620、aga2943、aga

5、3830分別屬于糖苷水解酶GH96、GH16、GH39、GH96、GH16、GH50家族。并對6條基因進行了外源重組表達，除aga1766和aga2578外源表達無活性外，其它4條基因外源表達均有活性，并將外源表達產物分別命名為重組瓊膠酶Aga2293、Aga1620、Aga2943、Aga3830。通過薄層層析法發(fā)現(xiàn)重組瓊膠酶Aga2293、Aga1620、Aga3830的瓊脂糖水解產物為新瓊四糖和新瓊六糖，Aga2943的水解產物為

6、新瓊二糖和新瓊四糖。結合生物信息學分析結果，初步確定基因aga2293、aga1620、aga3830為新的瓊膠酶基因。
　　使用鎳柱親和層析和梯度透析的方法對酶活最高的重組瓊膠酶Aga2293進行了純化和復性，經SDS-PAGE電泳檢測純度后，對其酶學性質進行了初步研究。發(fā)現(xiàn)重組瓊膠酶Aga2293的最適底物濃度為2％，最適反應溫度為40℃，≤45℃時酶活較穩(wěn)定，最適pH7，Cu2+對酶活有極大的抑制作用，Pb2+、Zn2+、C