磁分離靶蛋白-配體復(fù)合物快速篩選混合物配體庫的技術(shù).pdf

1、本論文提出一種基于磁分離靶蛋白-配體復(fù)合物快速篩選混合物配體庫的技術(shù)，其過程包括（a）將混合物樣品與適量外源參考配體混合作為用于篩選樣品（pMFS）；（b）啟動PMFS中所有配體與固定在納米磁珠上的靶蛋白競爭結(jié)合：（c）磁力回收靶蛋白.配體復(fù)合物，提取結(jié)合的配體；（d）定量PMFS和對應(yīng)結(jié)合配體提取物中每個可檢測配體色譜峰面積；（e）如所有必要條件都滿足，則計算候選配體與參考配體的相對親和力，否則需優(yōu)化PMFS和/或競爭結(jié)合系統(tǒng)的組成直

2、到滿足所有必要條件；（f）確定每個混合物庫成分中潛在有價值配體；（g）確定潛在有價值配體中的高親和力配體為潛在hit（s）；（h）通過競爭結(jié)合判斷潛在hit（s）特異性以確認(rèn)hit（s）；否則確定其它潛在有價值配體的特異性。 用HPLC-MS分析，以生物素衍生物與固定在納米磁珠上鏈親和素為模型，考察此技術(shù)用于測定平行液相組合合成（PLCS）單一預(yù)期配體混合物、PLCS制備多個預(yù)期配體混合物、粗天然產(chǎn)物中多個預(yù)期配體等親和力的可靠

3、性，及鑒定粗天然產(chǎn)物中痕量高親和力配體的可行性。 測定混合物中單一預(yù)期配體親和力時，維持競爭結(jié)合體系參考配體結(jié)合率低于10％，逐步增加PMFSs中候選配體量則候選配體結(jié)合率逐步降低，同時兩種配體的峰面積可大于各自線性響應(yīng)截距絕對值的5倍，候選配體相對親和力也逐步降低；當(dāng)二者結(jié)合率都低于10％后相對親和力達(dá)到下降曲線水平底部的均值可為該配體的相對親和力。 定量測定混合物中多個預(yù)期配體親和力時，對純化生物素衍生物的混合物和P

4、LCS制備的多生物素衍生物混合物，只要其中所含候選配體數(shù)量足夠少且含量差異足夠小，在相同的實驗條件下用HPLC-MS分析能成功篩選出多個混合物中最高親和力的配體。對此兩類樣品，其組成決定此方法可靠性。通過與高親和力參考配體競爭結(jié)合和同變性靶蛋白結(jié)合，可有效同步判斷混合物中多個候選配體的特異性。 如粗天然產(chǎn)物中候選生物素衍生物間含量差異較小，此技術(shù)也可同步測定其中有限數(shù)量候選配體的親和力和同步判斷其特異性。以前一輪回收的配體為樣品

5、進(jìn)行下一輪的篩選，通過競爭結(jié)合、磁分離后提取結(jié)合配體等過程的迭代進(jìn)行，理論上可實現(xiàn)混合物中高親和力配體的指數(shù)富集（EELHA）。用含有多個不同親和力和不同含量生物素衍生物的川芎甲醇提取液為樣品，證實該策略有效富集高親和力配體，從而快速發(fā)現(xiàn)混合物中含量僅2％但親和力高三倍的配體。為提高EELHA的效果，相鄰下輪篩選時靶蛋白量應(yīng)不多于上一輪回收配體總量的20％，但此迭代過程對應(yīng)的靶蛋白用量很大。EELHA對發(fā)現(xiàn)已知藥理活性粗天然產(chǎn)物中的痕量