SARS相關(guān)冠狀病毒M蛋白基因核酸疫苗的實驗研究.pdf

1、SARS(SevereAcuteRespiratorySyndrome)是一種傳染性強(qiáng)、病死率高、嚴(yán)重危害人民生命健康的傳染病。世界衛(wèi)生組織于2003年4月6日宣布引起SARS的病原體是一種新的病毒，屬于冠狀病毒家族，稱為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-Associatedcoronavirus，SARS-CoV)。SARS-CoV表現(xiàn)出許多不同于冠狀病毒的特性，為冠狀病毒中一個新的分支。目前，病毒性疾病尚無特效治療方法，對于SARS也

2、是一樣。所以，控制SARS的最好辦法是預(yù)防，而疫苗的開發(fā)則是建立有效防范措施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。DNA疫苗是繼病原體疫苗、亞單位疫苗之后的第三代疫苗，具有許多的優(yōu)越性。所以本研究選擇了SARS病毒DNA疫苗這一方向，以SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白之一——M蛋白基因作為研究對象。構(gòu)建針對SARS-CoVM蛋白基因的重組核酸疫苗，觀察其免疫小鼠后機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答的情況，探討其作為抗SARS-CoV疫苗的可能性。 本研究由兩部分組成：第一

3、部分為SARS-CoVM蛋白基因重組核酸疫苗的構(gòu)建。從GenBank上獲取SARS病毒株SIN2774的M蛋白基因序列，使用引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計，從中選擇最佳引物，并在引物5’端分別添加真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)多克隆位點中所包含的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點及保護(hù)堿基，以從新加坡獲得的SIN2774cDNA為模板，合適條件下進(jìn)行PCR，獲得SARS-CoVM基因片段(663bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)

4、EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后定向克隆于pcDNA3.1(+)載體，構(gòu)建包含SARS-CoVM基因片段的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/M。經(jīng)酶切及測序等方法鑒定重組質(zhì)粒的正確性。 第二部分為真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/M在小鼠體內(nèi)的免疫原性研究。把第一部分構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/M進(jìn)行大量提取，按常規(guī)DNA疫苗的免疫方法將pcDNA3.1(+)/M接種于健康BALB/c小鼠體內(nèi)，試驗分pcDNA3.1(

5、+)空載體組(50μg/只)、低劑量pcDNA3.1(+)/M質(zhì)粒組(50μg/只)、高劑量pcDNA3.1(+)/M質(zhì)粒組(100μg/只)。在免疫后的2、4、6周分別采集并分離小鼠血清，用ELISA法檢測其中抗SARS-CoV特異性抗體、相關(guān)細(xì)胞因子水平以及淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)活性。 實驗結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/M經(jīng)酶切鑒定顯示有正確大小的插入片段；DNA測序結(jié)果顯示插入片段M基因的序列與GenBank報告的序

6、列完全一致，而且外源基因定向插入的方向正確，未改變外源基因的閱讀框架。動物實驗結(jié)果顯示，實驗動物在接種重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/M后，其SARS-CoV特異性抗體的檢測均為陽性，且脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ含量升高，與接種pcDNA3.1(+)的空質(zhì)粒對照組之間有顯著性差異。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)活性也顯示增高趨勢。結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/M；構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/M能較好的誘導(dǎo)SARS-CoV特