早孕小鼠胚胎著床前后子宮內(nèi)膜microRNAs差異表達(dá)及miR-106b表達(dá)規(guī)律研究.pdf

1、目的：
　　 應(yīng)用microRNAs（miRNAs）芯片篩選早孕小鼠胚胎著床前后子宮內(nèi)膜差異表達(dá)miRNAs，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，運(yùn)用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測差異表達(dá)miRNAs調(diào)控的靶基因，為研究其在早孕小鼠胚胎著床過程中的作用打下基礎(chǔ)；通過數(shù)據(jù)庫的篩選，對靶基因指向與胚胎著床子宮內(nèi)膜增殖相關(guān)的miR-106b在早孕小鼠胚胎著床前后子宮內(nèi)膜表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，為研究miR-106b在胚胎著床過程中對子宮內(nèi)膜的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)

2、。
　　 方法：
　　 1.樣本的準(zhǔn)備：分別收集孕4天和孕6天的小鼠子宮內(nèi)膜組織。
　　 2.miRNAs芯片分析：提取小鼠子宮內(nèi)膜組織的總RNA，總RNA用miRCURYTM LNA Array labeling kit（Exiqon，Denmark）使用Cy3按照說明書標(biāo)記。Cy3標(biāo)記的RNA用miRCURYTM LNA Arrays（Exiqon，Denmark）進(jìn)行雜交。通過Gene Pix4000B掃描

3、儀和Gene Pix6.0軟件（Axon Instruments，Union City，CA）進(jìn)行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析。
　　 3.熒光定量PCR檢測部分差異表達(dá)miRNAs：根據(jù)miRNA成熟序列設(shè)計(jì)特異性的反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)miRNAPCR.上下游引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用U6作為內(nèi)參，進(jìn)行歸一化。
　　 4.生物信息學(xué)分析：應(yīng)用目前常用miRNAs靶基因預(yù)測網(wǎng)站Targetscan、Pictar、miR

4、Base來檢索差異表達(dá)miRNAs的預(yù)測靶基因。
　　 5.原位雜交：原位雜交檢測miR-106b在胚胎著床前后子宮內(nèi)膜的表達(dá)量和表達(dá)部位。
　　 結(jié)果：
　　 1.miRNAs芯片結(jié)果顯示：孕6天比孕4天上調(diào)2倍及以上的miRNAs有17個(gè)；下調(diào)2倍及以上miRNAs有18個(gè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示芯片數(shù)據(jù)可靠。通過Targetscan、Pictar、miRBase等數(shù)據(jù)庫篩查，初步獲得差異表達(dá)的部分miR

5、NAs多指向與增殖、凋亡和抗凋亡相關(guān)的靶基因。
　　 2.miRNAs芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和原位雜交顯示：miR-106b在孕4天的表達(dá)高于孕6天2倍以上，且主要表達(dá)在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，在腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞沒有表達(dá)。提示miR-106b可能通過調(diào)控其靶基因而調(diào)控早期妊娠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究結(jié)果顯示孕6天與孕4天相比，存在差異表達(dá)的miRNAs，提示

6、miRNAs可能在胚胎著床前后子宮內(nèi)膜中起重要的調(diào)控作用。
　　 2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR.進(jìn)一步驗(yàn)證了部分差異表達(dá)的miRNAs，對這些miRNAs在孕6天和孕4天子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)量進(jìn)行定量檢測，驗(yàn)證了miRNAs芯片結(jié)果的可靠性。
　　 3.利用生物信息學(xué)方法，預(yù)測差異表達(dá)的miRNAs的靶基因，推測這些miRNAs可能通過調(diào)節(jié)增殖、凋亡和抗凋亡相關(guān)的靶基因來調(diào)控胚胎著床。
　　 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢