NDRG2在心肌缺血再灌注損傷中Akt所介導(dǎo)的胰島素保護(hù)效應(yīng)中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(NDRG2),與其他NDRG2家族的蛋白存在約60％相似的氨基酸殘基。NDRG2與細(xì)胞生長(zhǎng),分化,應(yīng)激和激素的刺激反應(yīng)存在密切聯(lián)系.以往研究表明,NDRG2的表達(dá)可受到多種合成代謝和分解代謝激素調(diào)節(jié),比如地塞米松,雄激素 and醛固酮.盡管 NDRG2在心臟中高表達(dá),但它在心血管系統(tǒng)中的功能還廣泛未知。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),心肌缺血再灌注(I/R)損傷可改變心肌組織中NDRG2的表達(dá)。

2、r>　　心血管事件例如急性心肌梗死是引起患者致殘和致死的主因。冠狀動(dòng)脈發(fā)生梗塞后,臨床現(xiàn)有的挽救存活心肌的主要措施包括冠脈血運(yùn)的重建,即再灌注。但是,缺血組織的血運(yùn)重建本身可引發(fā)心肌的再灌注損傷,不僅可以造成細(xì)胞死亡,還可以引起心肌組織功能性的損傷,反而降低了血運(yùn)重建所帶來(lái)的益處。因此,明確再灌注損傷的具體分子機(jī)制和尋找新的目標(biāo)分子來(lái)緩解再灌注損傷已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。
　　很多文獻(xiàn)對(duì)于胰島素在缺血再灌注損傷中所起的心肌保護(hù)特性已有

3、了較為詳盡的報(bào)道。胰島素可以通過(guò)激活一系列胞內(nèi)蛋白激酶來(lái)保護(hù)心肌抵御缺血再灌注損傷,這些激酶被命名為再灌注損傷補(bǔ)救激酶(reperfusion injury salvage kinases:RISK),包括PI3K-Akt, JAK-STAT和ERK系統(tǒng)的激活。但是,胰島素發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制還沒(méi)有被完全闡述清楚。NDRG2作為蛋白激酶Akt的底物之一,可以參與Akt介導(dǎo)的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路。我們的前期研究表明,在Akt介導(dǎo)的胰島素保

4、護(hù)胰島β細(xì)胞抵抗游離脂肪酸引發(fā)的損傷中,NDRG2發(fā)揮了重要作用。但是,NDRG2是否有可能在胰島素心肌保護(hù)中發(fā)揮作用還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　在本研究中,我們首先觀察在心肌細(xì)胞和心肌組織在經(jīng)受缺血再灌注損傷過(guò)程中,NDRG2總蛋白和磷酸化蛋白水平的表達(dá)情況,以及其受到胰島素干預(yù)的調(diào)節(jié)情況和分子機(jī)制。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中,NDRG2的磷酸化水平的變化是否參與了Akt所介導(dǎo)的胰島素的心肌

5、保護(hù)效應(yīng)。
　　材料和方法：
　　1.雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重在140-180g之間,建立大鼠心肌缺血再灌注模型。采用腹腔注射戊巴比妥鈉溶液的方法麻醉大鼠,以體外量循環(huán)呼吸機(jī)保證術(shù)中動(dòng)物呼吸。在大鼠左側(cè)股動(dòng)脈中置入一根預(yù)先充滿肝素化生理鹽水的PE-50導(dǎo)管來(lái)監(jiān)測(cè)術(shù)中大鼠血壓。大鼠心跳速率通過(guò) ECG來(lái)測(cè)量。在大鼠的左胸部位作一切口,暴露心臟,以6-0的絲線圍繞冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)做一活結(jié)。缺血

6、30分鐘后,解開(kāi)線結(jié),恢復(fù)LAD血運(yùn)。假手術(shù)組接受開(kāi)胸等類似的的手術(shù)過(guò)程,除了阻斷LAD這一步驟。
　　2.在第一部分實(shí)驗(yàn)中,為了觀察NDRG2的磷酸化水平在心肌組織中的變化情況,我們首先將大鼠隨機(jī)分成以下幾個(gè)組:假手術(shù)組,單純?nèi)毖M(30 min),缺血30min后分別加1,2,3 or4 h的再灌注(n=5).在第二部分實(shí)驗(yàn)中,為了檢測(cè)胰島素對(duì)于Akt/NDRG2信號(hào)通路的效應(yīng),大鼠隨機(jī)分組并接受以下處理:(1)假手術(shù)組;(2

7、)安慰劑組(0.9%NaCl);(3)極化液GIK(葡萄糖:200 g/L,胰島素:60 U/L,鉀離子:60 mEq/L),從再灌注5min前開(kāi)始靜脈輸注4h(4 mL/kg/h);(4)
　　去胰島素極化液 GK(葡萄糖+鉀離子)(n=16).術(shù)前用小動(dòng)物超聲監(jiān)測(cè)大鼠心臟功能來(lái)建立基線標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.乳鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和體外模擬缺血/再灌注(SI/R)模型的建立;大鼠H9C2心肌細(xì)胞系和INS-1胰島素瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)

8、。
　　4. siRNA以及 lenti-shRNA的合成與轉(zhuǎn)染:siRNA的合成序列為:5'-CCAAACGUCCAGCGAUAUUCATT-3'。siRNAs以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,攜帶有GFP基因序列的對(duì)照慢病毒感染原代心肌細(xì)胞后,70–80%的細(xì)胞可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光信號(hào)。
　　5.在體動(dòng)物水平的病毒接種:在手術(shù)4天前,雄性SD大鼠以戊巴比妥鈉麻醉后,經(jīng)口氣管插管后

9、,體外呼吸機(jī)建立正壓通氣。在左側(cè)胸部第四肋間作一切口暴露心臟。用微量注射器抽吸病毒后,分別分三個(gè)點(diǎn)注射到即將缺血心肌處。
　　6.伊文氏藍(lán)/TTC染色測(cè)定心肌梗死范圍;TUNEL染色,免疫印跡法和流式細(xì)胞法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡;小動(dòng)物心臟超聲檢測(cè)大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS);反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)各基因mRNA表達(dá)水平;免疫印跡法檢測(cè)各總蛋白和磷酸化蛋白水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.NDRG2的磷酸

10、化水平在再灌注早期(1h)有輕度上升的趨勢(shì),但是其總蛋白水平無(wú)顯著差異。隨著時(shí)間的推移,NDRG2的磷酸化水平逐漸降低,并且在再灌注4h時(shí)達(dá)最低點(diǎn)。當(dāng)原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞在經(jīng)受體外模擬的缺血再灌注應(yīng)激下,我們也可以觀察到類似的趨勢(shì),NDRG2的磷酸化水平大約在恢復(fù)氧供6h時(shí)達(dá)最低點(diǎn)。
　　2.再灌注時(shí)期輸注 GK液(去胰島素極化液)可以顯著提高大鼠血糖濃度,但是再灌注4h末,GIK極化液輸注組和溶劑對(duì)照組兩組血糖水平無(wú)顯著性差異

11、。與溶劑組相比,GIK治療組在再灌注4h末,血漿中胰島素水平得到了顯著提高。
　　3.相比較GK治療組和溶劑對(duì)照組,GIK治療組的caspase3的活性形式表達(dá)水平顯著降低。免疫組化結(jié)果顯示,GIK治療組損傷心肌局部的黃褐色蛋白顯著減少,表明了caspase3的活性形式表達(dá)水平的降低。此外,TUNEL染色也顯示相同的趨勢(shì)。
　　4.與GK治療組和溶劑對(duì)照組相比,在再灌注24h后,胰島素治療組(GIK)心肌梗死區(qū)(INF)占危

12、險(xiǎn)區(qū)(AAR)百分比顯著減小。此外,小動(dòng)物超聲檢測(cè)大鼠的心功能顯示胰島素的使用可顯著提高心臟左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVES),而其它兩組在治療后心功能相對(duì)于非治療對(duì)照組無(wú)顯著性差異。
　　5.在缺血30min再灌4h后,胰島素的使用可以顯著的逆轉(zhuǎn)在缺血再灌注NDRG2和Akt的下降趨勢(shì),NDRG2的磷酸化位點(diǎn)為T(mén)hr348,Akt的磷酸化位點(diǎn)為Ser473.而NDRG2和Akt的總蛋白水平在給予胰島素干預(yù)后無(wú)顯

13、著變化。此外,當(dāng)給予原代心肌細(xì)胞模擬缺血再灌注損傷刺激后,胰島素的處理可以上調(diào) Akt在Ser473位點(diǎn)的磷酸化水平。胰島素的這一作用可被PI3K的抑制劑Wortmannin所阻斷。與此同時(shí),胰島素也可以上調(diào)NDRG2在Thr348位點(diǎn)的磷酸化水平,這一作用同樣可以被Wortmannin以及Akt激酶特異性的抑制劑所阻斷。
　　6.相比較單用胰島素,當(dāng)胰島素同Wortmannin或Akt抑制劑共同處理原代心肌細(xì)胞時(shí),caspase

14、3的活性形式的表達(dá)水平顯著提高。同時(shí),胰島素同Wortmannin或Akt抑制劑共處理組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞也較單用胰島素組顯著增多。此外,我們還培養(yǎng)了大鼠胚胎來(lái)源的心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞系并給予了相似的缺血再灌注處理。流式結(jié)果分析顯示,相較于單用胰島素組,胰島素同Wortmannin或Akt抑制劑共處理組凋亡的細(xì)胞數(shù)量顯著增多。
　　7.對(duì)照siRNA處理后,INS-1細(xì)胞NDRG2的表達(dá)無(wú)顯著變化。但是,NDRG2siRNA可

15、以對(duì)INS-1細(xì)胞中NDRG2的表達(dá)產(chǎn)生影響,且呈濃度梯度依賴性?；诖藄iRNA序列的NDRG2shRNA的慢病毒顆粒感染心肌細(xì)胞三天后,細(xì)胞NDRG2的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)。
　　8.盡管胰島素的處理誘導(dǎo)了Akt的激活,但是NDRG2的總蛋白水平核在Thr348位點(diǎn)的磷酸化水平均受到了抑制,NDRG2干涉后的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)出更高的caspase3活性形式的表達(dá)。同時(shí),在用對(duì)照病毒顆粒感染INS-1細(xì)胞后,胰島素處理可產(chǎn)生

16、明顯的保護(hù)作用。但是,在用攜帶特異性針對(duì)NDRG2的NDRG2shRNA病毒顆粒感染INS-1細(xì)胞后,即使用胰島素處理,TUNEL染色也顯示出顯著升高的凋亡細(xì)胞比例。
　　9.慢病毒顆粒局部注射24h后,免疫熒光染色結(jié)果顯示,對(duì)比非注射區(qū),注射區(qū)心肌局部CD11b呈陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量部分增多。在針對(duì)NDRG2的慢病毒顆粒注射9.慢病毒顆粒局部注射24h后,免疫熒光染色結(jié)果顯示,對(duì)比非注射區(qū),注射區(qū)心肌局部CD11b呈陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量部分

17、增多。在針對(duì)NDRG2的慢病毒顆粒注射96h后,NDRG2在注射區(qū)域局部心肌組織的mRNA和蛋白水平均顯著下降;而使用Scramble病毒后,相比對(duì)照組,注射區(qū)域NDRG2的蛋白水平無(wú)顯著差異。免疫組化染色結(jié)果也提示,注射區(qū)域,即在手術(shù)中將受到缺血的區(qū)域,NDRG2表達(dá)在三個(gè)不同的位點(diǎn)均得到顯著降低。但是,遠(yuǎn)離注射區(qū)域,比如室間隔和右室,心肌的NDRG2水平無(wú)顯著下調(diào)。此外,慢病毒顆粒的注射沒(méi)有誘導(dǎo)遠(yuǎn)離注射區(qū)域心肌NDRG2總蛋白和磷酸

18、化水平的變化。
　　10.當(dāng)以GIK極化液治療后,相比較Scramble病毒處理組,NDRG2干涉慢病毒處理組心肌組織的活性caspase3表達(dá)水平比Scramble病毒處理組心肌顯著提高;心肌組織中綠色TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著提高。此外,EB/TTC染色顯示,相比較Scramble病毒處理組,NDRG2干涉慢病毒處理組大鼠心肌梗死區(qū)域占危險(xiǎn)區(qū)百分比(INF/AAR)顯著提高。小動(dòng)物心臟超聲結(jié)果也提示,NDRG2干涉慢病毒處理組

19、的大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)均較Scramble病毒處理組顯著降低。
　　11.給予NDRG2干涉慢病毒處理后,鄰近區(qū)域心肌的NDRG2水平相比較遠(yuǎn)離區(qū)域無(wú)顯著降低。TUNEL染色也顯示,GIK治療后,NDRG2干涉慢病毒處理組和Scramble病毒處理組的鄰近區(qū)域的凋亡率無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：
　　我們?cè)谶@項(xiàng)研究中主要對(duì)在心肌缺血再灌注損傷損傷,NDRG2的磷酸化形式在胰島素發(fā)揮心肌保

20、護(hù)效應(yīng)過(guò)程中所扮演的角色進(jìn)行了探討,主要發(fā)現(xiàn)包括以下幾點(diǎn):第一,在心肌缺血再灌注過(guò)程中,NDRG2磷酸化水平呈下降趨勢(shì),有可能與Akt的磷酸化水平的變化相關(guān)。第二:再灌過(guò)程中的胰島素治療可以依賴PI3K/Akt途徑顯著提高NDRG2的磷酸化水平。第三,即使在有胰島素處理情況下,NDRG2的干預(yù)可加劇體外培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞的凋亡。第四也是最重要的一點(diǎn),在動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)中,人為的下調(diào)NDRG2的表達(dá)可顯著減弱胰島素治療所帶來(lái)的心肌保護(hù)作用。