幾丁質(zhì)酶的活性改良及固定化研究.pdf

1、幾丁質(zhì)酶是一類催化水解幾丁質(zhì)及其衍生物中的β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生N-乙酰胺基葡萄糖的糖基水解酶。幾丁質(zhì)被幾丁質(zhì)酶水解后，能產(chǎn)生多種不同聚合度的幾丁寡糖。這些幾丁寡糖具有多種生物活性，比如抗細(xì)菌和真菌活性，調(diào)控機(jī)體免疫能力及抗癌等功能。而且，幾丁質(zhì)酶能破壞植物寄生線蟲腸道和病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)成分。因此，幾丁質(zhì)酶在醫(yī)藥領(lǐng)域、環(huán)保領(lǐng)域和農(nóng)林業(yè)中具有十分廣泛的應(yīng)用價值。
　　本研究是針對實(shí)驗(yàn)室先前克隆的幾丁質(zhì)酶基因pachi，通過易

2、錯PCR技術(shù)構(gòu)建pachi基因的隨機(jī)突變庫，采用96深孔板和T7噬菌體結(jié)合的高通量篩選技術(shù)，以1％可溶性殼聚糖為底物，DNS為指示劑，對隨機(jī)突變庫進(jìn)行篩選。從大約12000個突變株中篩選到一株活性明顯提高的突變體PachiN35D，與野生型進(jìn)行氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，突變體的第35位氨基酸殘基由原來的天冬酰胺替換成天冬氨酸。比較分析野生型幾丁質(zhì)酶Pachi和突變體PachiN35D的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，對于可溶性殼聚糖底物，突變體PachiN35

3、D的最適溫度為50℃，比野生型Pachi的60℃下降了10℃。野生型Pachi在60℃水浴1h后，還能保持76％的活性，而突變體PachiN35D在55℃水浴1h后幾乎完全喪失活性。分析野生型和突變體的動力學(xué)常數(shù)，野生型Pachi的Km是36.1mg/mL，突變體PachiN35D的Km是13.3mg/mL，突變體對于可溶性殼聚糖底物的親和力提高了63％;野生型的kcat/Km值是0.37mL/mg/min，而突變體的kcat/Km值是

4、1.14mL/mg/min，表明突變體PachiN35D的催化效率比野生型Pachi提高了2.1倍，并且突變體PachiN35D的比活力是49.9U/mg，相比野生型Pachi的22.3U/mg提高了1.2倍。將幾丁質(zhì)酶突變體用于秀麗隱桿線蟲的生物測定，突變體的半致死濃度LC50為309.6μg/mL，比野生型的387.3μg/mL降低了20％，因此，突變體的殺線蟲活性提高了20％。
　　以納米SiO2材料為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，

5、采用共價交聯(lián)法對幾丁質(zhì)酶突變體PachiN35D進(jìn)行固定化研究。通過傅里葉紅外光譜儀和高倍電鏡掃描分析固定化前后納米SiO2材料的表征變化，檢測到固定化后的納米材料上幾丁質(zhì)酶上某些特征基團(tuán)的波峰，且固定化后材料粒徑不變，分布均勻，無明顯聚集現(xiàn)象。固定化酶Im PachiN35D的固定化率高達(dá)98％，酶比活力保留率達(dá)到70％。比較固定化前后幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)和動力學(xué)常數(shù)發(fā)現(xiàn)，固定化酶Im PachiN35D的最適溫度為55℃，相比未固定化

6、PachiN35D的50℃提高了5℃;在55℃水浴處理1 h后，突變體PachiN35D幾乎沒有活性，而固定化酶Im PachiN35D仍保留了56％的活性。分析固定化前后酶的動力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，兩者的Km，kcat，kcat/Km幾乎沒有變化，而固定化酶的比活力是未固定化酶的70％，可知固定化酶在提高了熱穩(wěn)定性的同時，還保留了固定化前幾丁質(zhì)酶的底物親和力，催化效率以及大部分比活力。因此，納米SiO2材料是幾丁質(zhì)酶固定化載體的最佳選擇之一，