具有不同數(shù)量幾丁質(zhì)結(jié)合域的雜交幾丁質(zhì)酶的構(gòu)建及特性分析.pdf

1、昆蟲(chóng)病原真菌是自然界控制昆蟲(chóng)種群數(shù)量的重要因素之一，具有直接穿透昆蟲(chóng)體壁而使其致病的獨(dú)特機(jī)制。在穿透昆蟲(chóng)體壁的過(guò)程中，真菌會(huì)分泌一系列的水解酶，如幾丁質(zhì)酶和蛋白酶，降解寄主體壁，幫助菌絲穿透。結(jié)構(gòu)分析表明，大多數(shù)幾丁質(zhì)酶具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括催化域、鉸鏈區(qū)和幾丁質(zhì)結(jié)合域。幾丁質(zhì)結(jié)合域能幫助幾丁質(zhì)酶結(jié)合到幾丁質(zhì)底物上，提高局部區(qū)域的酶濃度，從而促進(jìn)對(duì)底物的降解。然而目前發(fā)現(xiàn)的來(lái)自昆蟲(chóng)病原真菌的幾丁質(zhì)酶缺乏幾丁質(zhì)結(jié)合域。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明

2、，在不具有幾丁質(zhì)結(jié)合域的昆蟲(chóng)病原真菌幾丁質(zhì)酶Bbchitl上添加家蠶幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合域，可以提高幾丁質(zhì)酶Bbchitl對(duì)不溶性底物的結(jié)合及降解能力。在球孢白僵菌中超量表達(dá)該融合蛋白，菌株的毒力得到顯著提高。但是添加更多的幾丁質(zhì)結(jié)合域是否可以進(jìn)一步增強(qiáng)幾丁質(zhì)酶與底物的結(jié)合能力，促進(jìn)對(duì)底物的降解，從而進(jìn)一步提高菌株的毒力呢?基于此設(shè)想，本文在前期工作的基礎(chǔ)上構(gòu)建了具有多個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的雜交幾丁質(zhì)酶，并進(jìn)行了表達(dá)及特性分析。 獲得

3、的主要結(jié)果如下： 1．雜交幾丁質(zhì)酶畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建在具有一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的雜交幾丁質(zhì)酶Bbchitl-BmChBD(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)基礎(chǔ)上，構(gòu)建了具有兩個(gè)和三個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的雜交幾丁質(zhì)酶的酵母表達(dá)載體pPIC9K-Bbchitl-(BmChBD)<,2>和pPIC9K-Bbchitl-(BmChBD)<,3>。 2．雜交幾丁質(zhì)酶的酵母表達(dá)及特性分析在畢赤酵母中表達(dá)并純化了帶有1、2和3個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的雜交幾丁質(zhì)酶Bb

4、chitl-BmChBD、Bbchitl-(BmChBD)<,2>、Bbchitl-(BmChBD)<,3>和野生型幾丁質(zhì)酶Bbchitl。結(jié)合分析和酶學(xué)特性分析結(jié)果表明：1)在酶濃度為80μg/mL時(shí)，幾丁質(zhì)結(jié)合域的個(gè)數(shù)和雜交幾丁質(zhì)酶與粉末幾丁質(zhì)的結(jié)合存在劑量效應(yīng)，即隨著幾丁質(zhì)結(jié)合域數(shù)量的增加，雜交幾丁質(zhì)酶與粉末幾丁質(zhì)的結(jié)合能力增強(qiáng)。雜交幾丁質(zhì)酶Bbchitl-BmChBD、Bbchitl-(BmChBD)<,2>和Bbchitl-(

5、BmChBD)<,3>與粉末幾丁質(zhì)的結(jié)合率分別為 64.4％、67.4％和86.8％，明顯高于野生型幾丁質(zhì)酶(4.3％)。而酶濃度為40μg/mL 時(shí)，雜交幾丁質(zhì)酶與粉末幾丁質(zhì)的結(jié)合無(wú)明顯差異。2)添加幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)锥≠|(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH無(wú)明顯影響，野生型和雜交幾丁質(zhì)酶均在pH5.0和55℃的條件下具有最高的幾丁質(zhì)酶活性。雖然添加幾丁質(zhì)結(jié)合域提高了幾丁質(zhì)酶降解不溶性底物的能力，卻降低了雜交酶的熱穩(wěn)定性。 3．雜交幾丁質(zhì)酶球

6、孢白僵菌表達(dá)載體的構(gòu)建為了進(jìn)一步分析幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)η蜴甙捉┚玖Φ挠绊?，?gòu)建了Bbchitl-(BmChBD)<,2>和Bbchitl-(BmChBD)<,3>的球孢白僵菌表達(dá)載體 puc-bar∶∶gfp-Bbchitl-(BmChBD)<,2>和puc-bar∶∶gfp-Bbchitl-(BmChBD)<,3>。在下一步工作中，將進(jìn)行相應(yīng)的生測(cè)試驗(yàn)。 本論文研究表明添加2個(gè)和3個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域BmChBD可以增加雜交幾丁質(zhì)酶對(duì)