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文檔簡介
1、谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD; EC4.1.1.15)能以磷酸吡哆醛(PLP)為輔酶專一性地催化L-谷氨酸脫羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA),是生物催化法制備GABA的唯一酶。GABA是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸,具有降血壓、鎮(zhèn)靜安神、改善睡眠和記憶力等多種重要的生理功能,在食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于天然的GAD存在酶活低、熱穩(wěn)定性差
2、的缺陷,在大規(guī)模生成GABA的應(yīng)用中受到了很大的限制。本研究以短乳桿菌GAD為父本酶,利用拉氏圖獲取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息,通過定點突變的方法對GAD進(jìn)行分子改造。
首先,以熱穩(wěn)定性和活性為篩選目標(biāo),通過研究短乳桿菌GAD1407三維模擬結(jié)構(gòu)的拉氏圖,確定不穩(wěn)定氨基酸殘基位點K413,采用定點突變的方法構(gòu)建該位點的突變體,測定野生型酶和突變酶的熱穩(wěn)定性和活力。結(jié)果表明突變酶K413A和突變酶K413I分別在熱穩(wěn)定性和酶活力上獲得了提高
3、,突變酶K413A在50℃的半衰期為105 min,是野生酶的2.1倍;突變酶K413I熱穩(wěn)定性沒有明顯的提高,但其酶活力卻得到了有效提高,約為野生型的1.6倍。對突變酶K413A和突變酶K413I的酶學(xué)性質(zhì)分析表明,兩種突變酶底物親和力(Km)與野生型酶相差不大,而突變酶K413A和突變酶K413I的轉(zhuǎn)化數(shù)(Km)分別是野生型酶的133%和167%。通過三維結(jié)構(gòu)模型分析,發(fā)現(xiàn)突變酶對于催化活力和熱穩(wěn)定性的改善主要由于增加了蛋白質(zhì)分子內(nèi)
4、的疏水相互作用。
為了進(jìn)一步比較突變酶K413A和野生型酶的熱穩(wěn)定性,以鹽酸胍和脲為變性劑,利用熒光檢測法對野生型酶和突變酶K413A的去折疊過程進(jìn)行研究。結(jié)果表明:在激發(fā)波長為280 nm時,以鹽酸胍作為誘導(dǎo)劑時,兩種酶中色氨酸的最大發(fā)射峰都會發(fā)生紅移,色氨酸熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢;以脲作為誘導(dǎo)劑時,兩種色氨酸的最大發(fā)射峰也都會發(fā)生紅移,色氨酸熒光強(qiáng)度下降。突變酶K413A和野生型酶去折疊過程的熒光相圖檢測結(jié)果表明,
5、無論是以鹽酸胍還是脲作為誘導(dǎo)劑,兩種酶的去折疊過程都符合“三態(tài)模型”,說明隨著變性劑濃度的增加,野生型酶和突變酶K413A先從天然態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴糠终郫B中間態(tài),并最終轉(zhuǎn)變?yōu)槿フ郫B狀態(tài)。此外,還考察了變性劑對酶活力的影響,當(dāng)以鹽酸胍為變性劑時,野生型酶和突變酶K413A半失活的鹽酸胍濃度分別為0.4 mol/L和0.7 mol/L;當(dāng)以脲為變性劑時,野生型酶和突變酶K413A半失活的脲濃度分別為1 mol/L和2 mol/L,由此可知,在變性劑
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