萱藻(Scytosiphon lomentaria)的種質(zhì)保存技術(shù)研究.pdf

1、萱藻Scytosiphon lomentaria(Lyngbye.)Link隸屬于褐藻門，是一種廣泛生長(zhǎng)于北起波羅的海南至澳大利亞、智利等國(guó)沿海海域的大型經(jīng)濟(jì)海藻，在我國(guó)主要分布在遼東半島至廣東海陵島間的廣大海域。萱藻不但鮮美可口，還具有較高的營(yíng)養(yǎng)、保健等價(jià)值，是長(zhǎng)期以來(lái)備受沿海居民鐘愛的優(yōu)質(zhì)海洋蔬菜。此外，萱藻藥用價(jià)值較高，具有抗氧化、抗細(xì)菌、抗病毒以及抗腫瘤的特性。研究發(fā)現(xiàn)，萱藻在除氮磷、抗污等方面也能發(fā)揮較好的生態(tài)修復(fù)作用，是一種

2、具有廣闊開發(fā)前景的新型經(jīng)濟(jì)海藻資源。
　　萱藻的生活史為異形世代交替，由大型的葉狀配子體世代以及微小的孢子體世代組成。萱藻絲狀體是孢子體的形式之一，其體積小、繁殖快、耐受力強(qiáng)，是實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增以及工廠化大規(guī)模育苗的主要材料。萱藻絲狀體不僅易于培養(yǎng)和調(diào)控，還能通過無(wú)性生殖形成單室孢子囊并釋放游孢子，游孢子可進(jìn)一步發(fā)育成具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的葉狀體，因而萱藻絲狀體是萱藻種質(zhì)保存的最佳對(duì)象。對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)來(lái)講，豐富而優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源是其最為重要的物質(zhì)保障

3、和基礎(chǔ)，因而保護(hù)、開發(fā)并利用好萱藻的種質(zhì)資源有利于實(shí)現(xiàn)萱藻的良種化生產(chǎn)。本論文通過研究液體培養(yǎng)法、包埋脫水超低溫保存法、包埋脫水-20℃低溫保存法以及玻璃化-20℃低溫保存法對(duì)萱藻絲狀體種質(zhì)保存的影響，探討了各個(gè)種質(zhì)保存方法中不同因素對(duì)萱藻絲狀體保存后存活率及后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為萱藻種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建提供了理論依據(jù)、思路和方法，同時(shí)也為萱藻的工廠化育苗提供了技術(shù)指導(dǎo)。
　　本文的研究成果如下:
　　1、在液體培養(yǎng)法中:(1)溫度

4、對(duì)萱藻絲狀體保存效果的影響并不顯著，當(dāng)光強(qiáng)為5.4μmol/(m2·s)時(shí)，在6-18℃條件下均可實(shí)現(xiàn)萱藻絲狀體的長(zhǎng)期保存;(2)光照強(qiáng)度是影響萱藻絲狀體液體保存的主要因素，當(dāng)光照強(qiáng)度高于16.2μmol/(m2·s)時(shí)，萱藻絲狀體細(xì)胞代謝快，保存60d時(shí)細(xì)胞因缺乏營(yíng)養(yǎng)鹽變?yōu)闇\黃色或無(wú)色，原生質(zhì)體收縮，可見較高的光照強(qiáng)度不利于萱藻絲狀體的長(zhǎng)期保存，5.4μmol/(m2·s)條件下萱藻絲狀體細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，是萱藻絲狀體液體保存的最佳光強(qiáng)條

5、件;(3)在6-18℃，5.4μmol/(m2·s)條件下，萱藻絲狀體細(xì)胞的代謝及生長(zhǎng)速度較慢，用液體培養(yǎng)法保存60d后存活率仍在97％以上，而且萱藻絲狀體細(xì)胞狀態(tài)良好，顏色呈褐色，原生質(zhì)體充盈，可見6-18℃，5.4μmol/(m2·s)是萱藻絲狀體液體保存最適宜的條件。
　　2、在包埋脫水超低溫保存法中，蔗糖的預(yù)培養(yǎng)濃度和時(shí)間、萱藻絲狀體膠球的含水量、化凍溫度及萱藻絲狀體膠球的恢復(fù)時(shí)間均對(duì)萱藻絲狀體的存活率有一定影響。其中:(

6、1)通過蔗糖預(yù)培養(yǎng)可顯著提高萱藻絲狀體細(xì)胞的存活率，將萱藻絲狀體膠球在濃度為0.4mol/L的蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)6h，凍存后萱藻絲狀體的存活率最高;(2)萱藻絲狀體膠球凍存的最適含水量相對(duì)較低，約為15％，當(dāng)萱藻絲狀體膠球的含水量高于27％時(shí)，凍存后萱藻絲狀體的存活率均為0％;(3)化凍溫度不同，凍存后萱藻絲狀體細(xì)胞的存活率亦有較大的差別，40℃為凍存后萱藻絲狀體膠球的最佳化凍溫度;(4)將化凍的萱藻絲狀體膠球置于黑暗條件下進(jìn)行恢復(fù)，恢復(fù)

7、18h可顯著提細(xì)胞存活率;(5)在最佳的條件下，萱藻絲狀體經(jīng)包埋脫水超低溫保存后的存活率最高可達(dá)54.79％，恢復(fù)后的萱藻絲狀體與凍存前的萱藻絲狀體在形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面并無(wú)區(qū)別，絲狀體經(jīng)誘導(dǎo)后能夠產(chǎn)生正常的孢子囊，由萱藻孢子囊放散的孢子能夠發(fā)育成健康完整的萱藻葉狀體。
　　3、在包埋脫水-20℃低溫保存法中，萱藻絲狀體膠球的含水量是影響萱藻絲狀體凍存后存活率的關(guān)鍵因素，膠球含水量過高或者過低均會(huì)導(dǎo)致萱藻絲狀體包埋脫水-20℃低溫保存后

8、存活率的下降，15％是凍存萱藻絲狀體膠球最適宜的含水量，在該條件下，萱藻絲狀體低溫保存30d后的存活率仍在50％以上。
　　4、在玻璃化-20℃低溫保存法中，裝載液、裝載時(shí)間、玻璃化液和脫水時(shí)間是影響萱藻絲狀體凍存后存活率的主要因素。其中:(1)稀釋的玻璃化液不宣用于萱藻絲狀體細(xì)胞的裝載，LS5是萱藻絲狀體玻璃化-20℃低溫保存的最佳裝載液;(2)裝載時(shí)間過長(zhǎng)或過短均會(huì)對(duì)保存效果產(chǎn)生不利影響，萱藻絲狀體在室溫下裝載30min時(shí)，其

9、凍存后的存活率最高;(3)萱藻絲狀體用不同的玻璃化液脫水后，細(xì)胞凍存后的存活率顯著不同，若用VS2對(duì)萱藻絲狀體脫水，凍存效果最好;(4)在0-60min的脫水過程中，萱藻絲狀體細(xì)胞凍存后的存活率隨脫水時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)萱藻絲狀體在0℃下脫水30min時(shí)，其凍存后的存活率大大提高;(5)在最佳的條件下，萱藻絲狀體經(jīng)玻璃化-20℃低溫保存后的存活率最高可達(dá)38.42％，經(jīng)恢復(fù)，凍存前、后的萱藻絲狀體基本沒有區(qū)別，雖然凍存后的