楷杷離體培養(yǎng)及其在遺傳轉(zhuǎn)化與種質(zhì)保存中的應(yīng)用.pdf

1、本研究以不同品種枇杷為材料,首先進(jìn)行胚性培養(yǎng)物誘導(dǎo)與繼代保持、幼胚培養(yǎng)等離體培養(yǎng)研究,然后從胚性培養(yǎng)物中克隆乙烯合成的關(guān)鍵酶基因ACS和ACO,并進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACO反義基因轉(zhuǎn)化枇杷胚狀體試驗(yàn)以及枇杷試管苗離體種質(zhì)保存研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.枇杷胚性培養(yǎng)物的誘導(dǎo)與繼代保持
　　 以解放鐘枇杷花藥為材料,采用4因素3水平的L9(34)正交設(shè)計(jì),研究了不同蔗糖濃度和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)枇杷花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影

2、響。附加30 g·L-1蔗糖、2.0mg·L-12,4-D和0.5 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基較適合枇杷花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。試驗(yàn)并對(duì)本所沈慶斌碩士于2003從幼胚中誘導(dǎo)并篩選、已保存5年的胚性培養(yǎng)物進(jìn)行了研究,采用MS+0.5mg·L-12,4-D+-0.25 mg-L-1KT和MS+0.5mg-L-12,4-D+0.25 mg.L-1 KR+5mg·L-1 AgNO3兩種培養(yǎng)基交替繼代,枇杷胚性培養(yǎng)物的可以長(zhǎng)期繼代保持。

3、　　 2.枇杷幼胚培養(yǎng)與試管苗獲得
　　 本試驗(yàn)選取了4個(gè)產(chǎn)地不同的枇杷品種莆新本、森尾早生、長(zhǎng)紅3號(hào)和東湖早,分別對(duì)它們的幼胚萌發(fā)、試管苗增殖和生根進(jìn)行了研究。幼胚大小和基因型的差異導(dǎo)致幼胚萌發(fā)率不同;不同光照強(qiáng)度或?qū)⒆尤~上半部分切除對(duì)幼胚萌發(fā)率影響不大,但前者會(huì)導(dǎo)致試管苗形態(tài)結(jié)構(gòu)之間的差別;添加20g·L-1白糖的1/2MS培養(yǎng)基中枇杷幼胚的萌發(fā)率最高;不同MS濃度和白糖含量對(duì)4個(gè)枇杷品種幼胚萌發(fā)的影響規(guī)律是一致的,以莆新

4、本枇杷為例,隨MS濃度的降低,枇杷幼胚萌發(fā)率呈逐漸下降趨勢(shì),隨白糖含量的升高,枇杷幼胚萌發(fā)率呈逐漸上升趨勢(shì)。MS+1.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1或0.2 mg·L-1 NAA適宜作為不同品種枇杷試管苗的增殖培養(yǎng)基。1/2MS+0.4 mg-L-1 NAA較適合作為不同品種枇杷試管苗生根的培養(yǎng)基。
　　 3.枇杷胚性培養(yǎng)物ACS基因的克隆
　　 本試驗(yàn)首次以枇杷胚性培養(yǎng)物為材料,從其mRNA中克隆了ACS基

5、因。采用同源克隆方法,首先得到兩條大小同為523bp的ACS基因片段,再設(shè)計(jì)一對(duì)引物直接克隆枇杷ACS基因ORF。結(jié)果同時(shí)得到兩條ACS基因,其大小均為1464bp,編碼487個(gè)氨基酸;分別將其命名為EjACS-J和EjACS-2,兩個(gè)ACS基因之間相似性為92％,1464中核苷酸中有115個(gè)堿基不同。對(duì)ACS基因編碼的蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,兩個(gè)蛋白理論等電點(diǎn)不同;總體表現(xiàn)為親水性;EjACS-1蛋白不是一個(gè)跨膜蛋白:EjACS-2

6、蛋白可能形成一個(gè)N末端在膜外、方向由外向內(nèi)的跨膜螺旋;兩個(gè)ACS蛋白均不含有信號(hào)肽,預(yù)測(cè)它們可能為非分泌蛋白。本試驗(yàn)從枇杷基因組DNA中也克隆到ACS基因,命名為gACS,大小為2319bp,與EjACS-2序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),ACS基因組中含有3個(gè)內(nèi)含子,大小分別為89bp、106bp和660bp。
　　 4.枇杷胚性培養(yǎng)物ACO基因的克隆
　　 本試驗(yàn)從枇杷胚性培養(yǎng)物中克隆了ACO基因。采用同源克隆方法和3'RACE技

7、術(shù)得到枇杷ACO基因全長(zhǎng),將其命名為命名為EjACO-1。EjACO-1大小為1160bp,編碼322個(gè)氨基酸。對(duì)ACO基因編碼的蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。其理論等電點(diǎn)為5.35,屬于酸性蛋白;整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性,可能是一個(gè)非跨膜蛋白和非分泌蛋白。從枇杷基因組DNA中克隆到ACO基因,命名為gACO,大小為1517bp;與EjACO-1序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),ACO基因組中含有3個(gè)內(nèi)含子,大小分別為114bp、240bp和194bp。

8、r>　　 5.ACS反義基因轉(zhuǎn)化枇杷胚狀體
　　 本試驗(yàn)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將ACS反義基因?qū)腓凌伺郀铙w,采用正交設(shè)計(jì)對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了研究。通過統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率,得到本試驗(yàn)因素的較優(yōu)水平,分別為:侵染時(shí)間45min、共培養(yǎng)時(shí)間3d、重懸液中蔗糖濃度0 g·L-1、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間12d、農(nóng)桿菌重懸液OD6000.8,此時(shí),枇杷胚狀體GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高。
　　 6.枇杷試管苗離體種質(zhì)保存研究