草莓栽培品種離體再生及遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明本人聲明: 所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的 研究工作及取得的 研究成果。 盡我所知， 除了文中 特別加以標(biāo)注和致謝的地方外， 論文中不包含其他人己 經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做出的任何貢獻(xiàn)，均己在論文中作了明確說明并表示了謝意。研 究 生 簽 “ : 甲 礴) - “介年

2、3月 I 日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了 解中國 農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、 使用學(xué)位論文的規(guī)定， 即: 學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印 件及磁盤， 允許論文被查閱和借閱， 可以 采用影印、 縮印或掃描等復(fù)制手段保存、 匯編學(xué)位論文。 同意中國農(nóng)業(yè)大學(xué)可以 用不同方式在不同媒體上發(fā)表、 傳播學(xué)位論文的 全部或部分內(nèi)容。( 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名: 3 月導(dǎo)師簽名: 子 一 月/ 日/ / 日功國農(nóng)坐 試. 筍娜1動(dòng)t 尹

3、玻舉二， 有 徽賽若召禪浦布粵生漢遺洋洋必必開男制 農(nóng)桿菌的 生長， 此時(shí)“ 哈尼” 不定芽 再生率略有下降。 繼續(xù) 提高C a r b 濃度至5 0 0 m g / l ,再生頻率明 顯下降。( 二) C B F I 基因?qū)Σ菽沟倪z傳轉(zhuǎn)化1 . 基因型是影響草毒遺傳轉(zhuǎn)化的 重要因素。 對再生頻率較高的“ 豐香” 、 “ 哈尼” 、 “ 土特拉” 、 “ 達(dá)斯萊克 特” 四 個(gè)基因型進(jìn)行了 轉(zhuǎn)化， 分別 得到了3 . 5 7 %,

4、4 . 8 1 % , 2 . 1 5 % , 1 3 . 7 %的轉(zhuǎn)化頻率。2 . 經(jīng)乙 WT香 酮 ( A S , 5 0 , 1 0 0 m g / 1 ) 、 水 楊酸 ( S A , 5 0 , 1 0 0 m g / l ) 分y 9 1 處 理6 h 的農(nóng)桿菌侵染葉盤， 可以 顯著提高 “ 哈尼” 的 轉(zhuǎn)化頻率; 對于葉柄， 經(jīng)A S 1 0 0 m g / l 處理后轉(zhuǎn)化頻率由8 . 3 3 % 提高到

5、了 1 8 . 3 3 %, 其它處理對轉(zhuǎn)化率沒有影響。3 . 對于L B A 4 4 0 4介導(dǎo)的基因 轉(zhuǎn)化， 葉盤在菌液中 浸泡 1 -7 m i n都是可行的: 農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)時(shí)間在2 - 4 d 的范圍內(nèi)， 都得到了 較好的結(jié)果，以 共培養(yǎng)4 d為佳。 在分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2 - 4 d 的“ 土特拉” ， 抗性芽的誘導(dǎo)率高于未經(jīng)處理及預(yù)培養(yǎng)6 d 的 處理， 預(yù)培養(yǎng)2 d 時(shí)抗性芽的 誘導(dǎo)率最高。 對于 “ 哈尼”

6、和 “ 豐香” ， 預(yù)培養(yǎng)則降 低了 抗性芽的誘導(dǎo)率。4 . 選擇方式對草萄的遺傳轉(zhuǎn)化率影響很大。 對于 “ 土 特拉” ， 前期選擇不利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長， 未能獲得轉(zhuǎn)化芽， 宜采取延遲選擇或后期選擇的方式。 對于 “ 豐香” ， 延遲選擇和后期選擇都明 顯提高了 轉(zhuǎn)化率， 尤以后期選擇更為明顯。 對于 “ 哈尼” ，前期選擇和延遲選擇對轉(zhuǎn)化率的影響不大， 但后期選擇同 樣促進(jìn)了 轉(zhuǎn)化率的提高。 因 此， 對于草驀葉盤的遺傳轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)

7、之后不立即進(jìn)行抗性篩選， 而在脫菌培養(yǎng)基中恢復(fù)生長一定階段，對于獲得轉(zhuǎn)化體很重要。 后期選擇時(shí)， 抗生素能夠有效地淘汰非轉(zhuǎn)化芽， 從而避免嵌合體的產(chǎn)生。5 . 以0 . 5 m n 、 大小、 帶 有2 - 4 個(gè)葉 原基的 生 長點(diǎn)為 外 植體 進(jìn)行轉(zhuǎn) 化， “ 豐香” 、 “ 星都1 號” 、 “ 星都2 號” 等 3 個(gè)品 種分別得到了3 7 . 5 % 、 2 0 % 、 3 3 . 3 % 的轉(zhuǎn)化率。 但利用生長點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化存在

8、著取材時(shí)間受限 制、 操作耗時(shí)、 帶菌嚴(yán)重、 污染率高以 及容易出 現(xiàn)嵌合體等局限性。6 . 對1 9 8 個(gè) 抗性植 株株系 進(jìn)行了P C R 檢測， 其中5 4 個(gè) 株系的D N A經(jīng) 擴(kuò)增后產(chǎn)生了與 陽 性 對 照 相 同 的 特 異 擴(kuò) 增 帶， 其 片 段 大 小 約 為6 4 0 b p ， 與( ; B F I 相 符。 對P C R陽 性 植株和對照植株進(jìn)行了雜交檢測， P C R陽性條帶均有陽性反應(yīng)信號， 而P C R

9、陰 性條帶未檢測到雜交信號。 這表明外源基因已 整合進(jìn)草夸轉(zhuǎn)化植株的基因組中。7 對轉(zhuǎn)基因 株系2 0 1 0 - 5 - 5 及對照品種“ 哈尼” 進(jìn)行了 生物學(xué)性狀的比 較， 轉(zhuǎn)基因 植株在植株、 葉片、 花序、 種子、 甸旬莖、 果實(shí) 等方面與 對照品 種并 無明 顯差異。 但在開 花結(jié)果時(shí)期上， 卻明顯地早于對照品種， 盛花期早于對照8 d , 盛果期早于對照1 1 d .8 . 經(jīng)生長恢復(fù)實(shí)驗(yàn)及電導(dǎo)法測定葉片的 抗寒性后表明