pTAC7調(diào)控?cái)M南芥葉綠基因表達(dá)的機(jī)理研究.pdf

1、葉綠體是高等植物細(xì)胞半自主性細(xì)胞器，其自身含有基因組。葉綠體基因的表達(dá)需要兩類RNA聚合酶：核基因編碼的RNA聚合酶（NEP）和質(zhì)體編碼的RNA聚合酶復(fù)合物（PEP）的參與，其中 PEP是葉綠體中主要的RNA聚合酶，其含有四個(gè)核心亞基α、β、β’、β’’和一些重要的外圍蛋白，其調(diào)節(jié)機(jī)制是十分復(fù)雜的，組分的功能多數(shù)尚不清楚。pTAC7是葉綠體編碼的RNA聚合酶復(fù)合物組分之一，本實(shí)驗(yàn)室早期獲得ptac7兩個(gè)等位突變體ptac7-1和ptac

2、7-2，都呈現(xiàn)白化表型，它們的葉綠體發(fā)育嚴(yán)重受損，PEP負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的葉綠體基因的表達(dá)均低于野生型，表明了pTAC7參與調(diào)控質(zhì)體基因表達(dá)。
　　本論文中，我們構(gòu)建了pTAC7基因組融合標(biāo)簽蛋白的植株。融合4xMYC和GFP標(biāo)簽的pTAC7的基因組序列能夠成功互補(bǔ)ptac7-2突變體，這表明，融合標(biāo)簽后的蛋白是有功能的。利用激光共聚焦顯微鏡觀察了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系pTAC7:GFP的標(biāo)簽植株，結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)融合有GFP的pTAC7蛋白定位

3、于葉綠體內(nèi)。進(jìn)一步分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株中的葉綠體、類囊體和基質(zhì)，并利用特異性的MYC、GFP抗體免疫雜交分析，結(jié)果表明，pTAC7與葉綠體類囊體緊密聯(lián)系。利用pTAC7:MYC標(biāo)簽植株結(jié)合免疫共沉淀和質(zhì)譜分析，共鑒定到120個(gè)葉綠體蛋白，其中包括PEP的核心亞基rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2以及pTAC2、pTAC3、pTAC10、pTAC6、pTAC14、Trxz、FLN1、FLN2、FSD2的PAPs蛋白。利用pTA

4、C7:MYC標(biāo)簽植株提取類囊體膜，BN-PAGE結(jié)合二項(xiàng)SDS-PAGE電泳表明，pTAC7定位于669kD的復(fù)合物中，與rpoB定位于669kD的PEP復(fù)合物的位置一致。這些結(jié)果證實(shí)，pTAC7與核心亞基緊密結(jié)合，是另一個(gè)PAP蛋白。另外，除了鑒定到PEP復(fù)合物組分中的蛋白外，我們還鑒定到葉綠體中的7個(gè)核糖體蛋白，2個(gè)分子伴侶蛋白及參與質(zhì)體轉(zhuǎn)錄本加工有關(guān)的2個(gè)PPR蛋白。這些蛋白可能作為與pTAC7相互作用的候選蛋白。本論文為pTAC