基于殼聚糖類的組氨酸標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)的制備及應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)不僅是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且也是生物體內(nèi)的功能性大分子。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們通過基因重組技術(shù)利用微生物大量表達(dá)功能性蛋白，比如可食性功能蛋白，藥物蛋白等，而這些蛋白質(zhì)的分離純化是蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)功能性研究的前提和基礎(chǔ)，并且增加蛋白樣品的純度和保持樣品的活性是各種蛋白質(zhì)分離純化的共同目的，因此研究開發(fā)新穎的蛋白純化介質(zhì)是一熱點。
　　殼聚糖是地球上僅次于纖維素的第二大可再生資源，是一種天然無毒的N-乙酰氨基葡萄糖組成的

2、長鏈多糖，因其較好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，近年來逐漸在HIC(疏水相互作用色譜)上得到廣泛應(yīng)用。本課題有機(jī)結(jié)合殼聚糖的特性和IMAC(固定化金屬離子親和色譜)技術(shù)，在殼聚糖長鏈中通過有機(jī)合成手段引入螯合金屬離子強(qiáng)的配體乙二胺四乙酸(EDTA)，并螯合過渡金屬，用于組氨酸標(biāo)簽蛋白的分離純化。進(jìn)一步對純化介質(zhì)的重復(fù)利用能力和回收再生方法進(jìn)行探究，旨在開發(fā)新的經(jīng)濟(jì)、快速、簡便、環(huán)保的蛋白純化介質(zhì)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)以殼聚糖

3、為原料，制備得到EDTA-殼聚糖;利用SEM(掃描電鏡)，TEM(透射電鏡)，F(xiàn)T-IR(傅里葉變換紅外光譜)，TGA(熱重分析)等對其進(jìn)行表征和分析;考察了過渡金屬離子(Ni2+、Cu2+、Zn2+)與EDTA-殼聚糖在不同吸附時間、pH、初始濃度等因素下的金屬離子螯合情況，并用ICP-MS(電感耦合等離子體質(zhì)譜)測定金屬離子的結(jié)合量，結(jié)果表明:EDTA基團(tuán)很好的枝接到了殼聚糖主體上，而且在吸附時間為3小時，pH值為4.0，初始濃度為

4、1.6mg/mL時，EDTA-殼聚糖對三種金屬離子的吸附達(dá)到最大值;
　　(2)以組氨酸標(biāo)簽增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-(His)6-NH2為研究對象來探究M2+-EDTA-殼聚糖與M2+-殼聚糖(M=Ni、Cu、Zn)對組氨酸標(biāo)簽增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP-(His)6-NH2)的親和性能，同時探究了孵育時間、離子強(qiáng)度、緩沖液pH、咪唑洗脫濃度對目標(biāo)蛋白親和吸附及純度的影響。結(jié)果表明:蛋白與介質(zhì)在40min內(nèi)就可以達(dá)到吸附平衡

5、，pH和離子強(qiáng)度可以改變?nèi)芤褐徐o電強(qiáng)度和疏水相互作用來影響蛋白與介質(zhì)的結(jié)合，使得不同條件下M2+-EDTA-殼聚糖(M=Ni，Cu，Zn)對蛋白親和量各有不同，同時在很大程度上影響了目的蛋白純度;
　　(3)考察此純化體系對E.coli表達(dá)的EGFP-(His)6-NH2和Kana-(His)6-NH2的分離純化。結(jié)果表明:當(dāng)緩沖液pH為7.2，離子強(qiáng)度為500 mmol/L NaCl，洗脫緩沖液含500 mmol/L咪唑，得到純

6、度約為95％EGFP-(His)6-NH2目標(biāo)蛋白;當(dāng)緩沖液pH為6.2，離子強(qiáng)度為500mmol/L NaCl，洗脫緩沖液含200 mmol/L咪唑，得到純度約為90％的Kana-(His)6-NH2目標(biāo)蛋白;
　　(4)研究了純化介質(zhì)的重復(fù)利用能力和再生方法。結(jié)果表明:①M2+-EDTA-殼聚糖(M=Ni，Cu，Zn)表現(xiàn)出突出的重復(fù)利用性能，在前5次的重復(fù)利用中，對蛋白的結(jié)合率僅僅表現(xiàn)出了微量的下降，分別下降了3.9％(Ni