抗多重耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株SC-2的物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、多重耐藥性金黃色葡萄球菌（Methicillin—resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是一種遍布全球的高致死病原菌，被稱為“超級(jí)細(xì)菌”，目前MRSA感染已經(jīng)超過艾滋?。℉IV）、結(jié)核病和病毒性肝炎成為患者首位致死原因，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。MRSA對(duì)常見抗菌藥物耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，臨床使用的首選藥物萬(wàn)古霉素也已分離出耐藥菌株，給臨床用藥帶來(lái)了巨大的困難。尋求能夠有效替代萬(wàn)古霉素的抗MRSA先導(dǎo)化合物，開發(fā)

2、治療MRSA感染的新型抗菌藥物具有重大意義。
　　本課題以MRSA為指示菌篩選出一株高產(chǎn)生物活性物質(zhì)的芽孢桿菌，在對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化化后，系統(tǒng)研究了發(fā)酵液中抗MRSA有效成分的分離方法、結(jié)構(gòu)鑒定、體外活性評(píng)價(jià)及其含量測(cè)定。獲得如下成果：
　　1.從45株芽孢桿菌中篩選出一株對(duì)MRSA具有較強(qiáng)抑制作用且穩(wěn)定性好的菌株SC-2，通過對(duì)其形態(tài)觀察、生理生化特征及16S rDNA序列的測(cè)定，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillu

3、s subtilis）。
　　2.優(yōu)化出菌株SC-2的發(fā)酵培養(yǎng)基：C6H12O62.0％、黃豆粉0.5%、CaCO30.05%,pH7.0；菌株SC-2產(chǎn)抗MRSA活性物質(zhì)的種子液培養(yǎng)條件:溫度36℃、接種量5%（V/V）、裝液量1000mL/2000mL瓶、時(shí)間16h；50L發(fā)酵罐參數(shù):溫度36℃、接種量5%（V/V）、轉(zhuǎn)數(shù)150r/min，通氣量1.5m3/h，罐壓0.05MPa，裝液量25L;700L發(fā)酵工藝:溫度36℃、接

4、種量7%（V/V）、轉(zhuǎn)數(shù)150r/min，通氣量21m3/h，罐壓0.05MPa,裝液量350L。
　　3.菌株SC-2發(fā)酵液抗MRSA活性提取物的制備工藝：采用納濾膜濃縮初步確定了SC-2發(fā)酵液中主要活性成分的分子量（200-1000）；篩選出HP20大孔吸附樹脂對(duì)SC-2膜濃縮液進(jìn)行脫色，參數(shù)為：上樣量7BV,吸附流速2BV/h,再生溶劑為50%乙醇鹽酸溶液（2%HCI）；篩選出AmberliteXAD16N大孔吸附樹脂提取菌

5、株SC-2所產(chǎn)活性物質(zhì)的工藝參數(shù)：吸附量3.5BV，吸附流速為1BV/h,洗脫溶劑為20%乙醇溶液，洗脫體積3.5BV，洗脫流速1BV/h；最后用75%乙醇沉淀去除雜質(zhì)。整個(gè)工藝簡(jiǎn)單，去雜率達(dá)到80%，最終粗提物的抗菌活性與同濃度的萬(wàn)古霉素相當(dāng)。
　　4.采用硅膠柱層析梯度洗脫收集活性組分，然后經(jīng)過Sephadex G-10過濾，最終利用HPLC制備得到一肽類抗MRSA活性成分G2-Ⅱ，純度大于95%。化合物G2-Ⅱ通過質(zhì)譜、氨基

6、酸N端測(cè)序、氨基酸組成分析，并與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)物比較，初步確定該化合物是由Ala-Lys-APPA組成的分子量為376.3的三肽化合物，分子式為C14H25N4O6P。
　　5.建立了HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中活性化合物G2-Ⅱ含量的方法，色譜條件：Welchrom LP-C18(250mm×4.6mm，5um)，流動(dòng)相甲醇-水（1:99→3:97，0-30min），流速0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)204nm，進(jìn)樣量10uL，柱溫為2

7、5℃。結(jié)果顯示，化合物G2-II在5.0μg～25.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=2E+06x+870660，r=0.9996；采用該方法測(cè)定出菌株SC-2發(fā)酵液中活性化合物G2-II的含量約為0.90～0.93mg/L。
　　6.化合物G2-Ⅱ?qū)δ退幗瘘S色葡萄球菌、耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、痤瘡丙酸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌、白色念珠菌、馬拉色菌等常見致病菌都具有良好的拮抗作用，其抗菌譜較廣。G2-II對(duì)MRSA的M