活性氧、FOXO3a與高濃度葡萄糖環(huán)下小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯的相關(guān)性研究.pdf

1、妊娠合并糖尿病的育齡期婦女容易出現(xiàn)胚胎丟失、早期流產(chǎn)等，造成這一現(xiàn)象的原因可能與其血漿葡萄糖濃度過高導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常密切相關(guān)。研究表明，暴露于高濃度葡萄糖環(huán)境下的早期胚胎生長發(fā)育受抑制，出現(xiàn)胚胎發(fā)育阻滯的現(xiàn)象明顯增加。然而，高血糖抑制早期胚胎發(fā)育的具體機制尚不清楚。已有的研究表明，高葡萄糖環(huán)境中，活性氧簇（Reactiveoxygenspecies，ROS）的產(chǎn)生量顯著增加。ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA損傷，嚴(yán)重時

2、可導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙。
　　FOXO3a是同ROS相聯(lián)系的重要轉(zhuǎn)錄因子，也是目前研究細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷最重要的蛋白之一。研究表明，高濃度的葡萄糖通過誘導(dǎo)ROS過量的產(chǎn)生，導(dǎo)致FOXO3a被磷酸化并失去活性，并使其靶基因—FOXO3a依賴的錳過氧化物歧化酶(manganesesuperoxidedismutase)表達(dá)降低，進(jìn)而產(chǎn)生更多的ROS，并加速氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的病理進(jìn)程。研究顯示，F(xiàn)OXO3a對細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)作用可改善

3、胚胎的發(fā)育，然而，F(xiàn)OXO3a是否參與了高濃度葡萄糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷而導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯，尚須進(jìn)一步研究。
　　目的
　　在小鼠胚胎培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖，觀察其生長和發(fā)育情況，同時在胚胎發(fā)育的不同時期對ROS含量和FOXO3a的表達(dá)進(jìn)行檢測，研究不同濃度葡萄糖條件下胚胎發(fā)育阻滯與ROS、FOXO3a的關(guān)系，試圖探討糖尿病婦女胚胎發(fā)育異常的機理并為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法
　　對SPF級昆明系雌性小鼠

4、行超促排卵處理，注射HCG后合籠，斷頸法處死小鼠后收集合子，基于胚胎培養(yǎng)基中補充葡萄糖溶液后葡萄糖終濃度的高低而將實驗分為四組:control組（不添加葡萄糖）、5mM組、15mM組和25mM組，將合子置于以上四個分組的培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察不同濃度葡萄糖條件下胚胎發(fā)育的情況。在胚胎發(fā)育的不同階段（合子期、2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期及囊胚期），采用DCFH-DA染料活細(xì)胞染色法檢測ROS的含量，細(xì)胞免疫熒光染色檢測胚胎中FOXO3a蛋白

5、的表達(dá)情況，同時通過RealTimePCR檢測FOXO3amRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1.高濃度葡萄糖影響早期小鼠胚胎發(fā)育
　　鼠胚體外培養(yǎng)結(jié)果表明:隨著培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的增高，鼠胚的囊胚形成率不斷下降，而2-細(xì)胞胚胎發(fā)育阻滯率不斷升高。15mM組、25mM組的囊胚形成率（分別為50.0％、43.3％）明顯低于control組和5mM組(分別為69.9％、63.6％)（P＜0.05）;而15mM組和25mM組胚胎

6、發(fā)育阻滯率(分別為37.5％、38.9％)明顯高于control組和5mM組(分別為19.4％、21.2％)(P＜0.05)。
　　2.ROS含量的檢測
　　ROS檢測結(jié)果表明:相對于合子、4-細(xì)胞和囊胚期胚胎，小鼠2-細(xì)胞期胚胎ROS的水平明顯升高(P＜0.05);15mM組和25mM組2-細(xì)胞、4-細(xì)胞期胚胎內(nèi)ROS水平明顯高于control組和5mM組(P＜0.05)，囊胚期胚胎ROS水平隨糖濃度升高而上升，但組間差異

7、無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.FOXO3a的表達(dá)
　　胚胎細(xì)胞免疫熒光染色的結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO3a蛋白在胚胎發(fā)育的各時期均有不同程度的表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞漿中。行Real-timePCR對FOXO3a在RNA水平的檢測結(jié)果顯示:不同濃度葡萄糖培養(yǎng)鼠胚，在胚胎發(fā)育的各時期，F(xiàn)OXO3a的表達(dá)與ROS的相對含量密切相關(guān)，2-細(xì)胞期胚胎FOXO3aRNA表達(dá)水平相對于其他發(fā)育時期明顯升高(P＜0.05);伴隨著胚胎繼續(xù)

8、發(fā)育，F(xiàn)OXO3a的表達(dá)水平逐漸下降。對于同一發(fā)育時期胚胎而言，隨著糖濃度的升高，2-細(xì)胞、4-細(xì)胞期胚胎FOXO3aRNA表達(dá)水平降低，其中15mM組和25mM組顯著低于control組和5mM組(P＜0.05);而對于囊胚期胚胎，F(xiàn)OXO3aRNA表達(dá)的組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論。
　　1.胚胎培養(yǎng)液中高濃度的葡萄糖抑制早期胚胎發(fā)育，可導(dǎo)致發(fā)育阻滯。
　　2.高濃度葡萄糖可能誘導(dǎo)胚胎ROS過量