P4Hα1在不同剪切力誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及對(duì)平滑肌細(xì)胞膠原影響.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　Ⅰ 過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)不同剪切力誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠粥樣硬化斑塊的影響
　　目的：
　　1.通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)P4Hα1基因的過(guò)表達(dá)，觀察過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)剪切力作用下的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響;
　　2.比較不同剪切力作用下，P4Hα1介導(dǎo)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響。
　　方法：
　　1.構(gòu)建動(dòng)物模型與分組
　　60只8周齡雄性Apo

2、E-/-小鼠在手術(shù)前2周始全程給予高脂飲食（0.25％膽固醇+15％脂肪）。參照Cheng等人文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)右頸總動(dòng)脈實(shí)施套管術(shù)。
　　60只小鼠于右側(cè)頸總動(dòng)脈放置硅膠套管，術(shù)后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)2周，將小鼠隨機(jī)分為三組(n=20):NS組（Mock組）、空病毒組（Lenti-EGFP組）及Lenti-P4Hα1組。每組小鼠分別于尾靜脈注射200ul生理鹽水、3.5×106TU的Lenti-EGFP病毒懸液及3.5×106TU的P4Hα1

3、病毒懸液。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)2周，行安樂死后取材。
　　2.血液學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)
　　處死小鼠前麻醉小鼠后從尾靜脈留取血液，在4℃以2500r/min離心15分鐘，留取血清，血清中的總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)及甘油三酯(TG)均采用酶學(xué)法進(jìn)行檢測(cè);ELISA試劑盒檢測(cè)血清中的羥脯氨酸。
　　3.斑塊組織免疫組化及病理學(xué)檢查
　　右頸動(dòng)脈組織取材后置于4％甲醛固定液中固定，

4、采用OCT包埋標(biāo)本，以5μ m的厚度連續(xù)冰凍切片，分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色分析斑塊的形態(tài);油紅O染色用于分析脂質(zhì)沉積情況;天狼猩紅-苦味酸染色用于分析膠原的含量;CD68免疫組化染色觀察巨噬細(xì)胞的含量。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況
　　三組實(shí)驗(yàn)小鼠血的TG、TC、LDL-C、HDL-C水平和體重沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);羥脯氨酸水平在lenti-P4Hα1組比其他兩組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

5、0.05)。表明過(guò)表達(dá)P4Hα1對(duì)小鼠體內(nèi)的血脂水平無(wú)明顯影響。
　　2.慢病毒轉(zhuǎn)染后P4Hα1過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)
　　Western Blot及RT-PCR檢測(cè)三組小鼠頸動(dòng)脈斑塊組織內(nèi)P4Hα1蛋白及mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與MOCK組及Lenti-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組內(nèi)P4Hα1的蛋白表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與MOCK組及Lenti-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組內(nèi)P

6、4Hα1的mRNA水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.三組小鼠不同剪切力部位斑塊面積的比較
　　三組小鼠斑塊組織行HE染色，測(cè)量三組不同剪切力部位斑塊的面積，在Mock組及Lenti-EGFP組，OSS部位斑塊面積較LSS部位減小(P＜0.05);在LSS部位，Lenti-P4Hα1組較MOCK組及Lenti-EGFP組斑塊面積增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);在OSS部位，斑塊面積在Lenti-P4

7、Hα1組較MOCK組及Lenti-EGFP組均增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.不同剪切力部位三組小鼠頸動(dòng)脈斑塊成分比較
　　天狼猩紅染色檢測(cè)斑塊內(nèi)膠原含量，結(jié)果顯示:在Mock組及Lenti-EGFP組，OSS部位斑塊內(nèi)膠原含量較LSS部位增多(P＜0.01);在LSS部位，與Mock組及Lenti-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組斑塊內(nèi)膠原的含量及纖維帽的厚度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，

8、P＜0.05);在OSS部位:Lenti-P4Hα1組斑塊內(nèi)膠原的含量及纖維帽的厚度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　油紅O染色法測(cè)定斑塊中的脂質(zhì)含量，結(jié)果顯示:在LSS部位，P4Hα1轉(zhuǎn)染組斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量與生理鹽水組及空病毒組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05);在OSS部位，脂質(zhì)聚集在三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　CD68染色檢測(cè)斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在LSS部位，與Mock組及Lenti

9、-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量明顯減少(P＜0.01);在OSS部位，Lenti-P4Hα1組斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量明顯減少(P＜0.01)。
　　5.P4Hα1過(guò)表達(dá)對(duì)斑塊中TGF-β1水平的影響
　　Western Blot檢測(cè)各組小鼠頸動(dòng)脈斑塊組織內(nèi)TGF-β1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與MOCK組及Lenti-EGFP組比較，Lenti-P4Hα1組內(nèi)TGF-β1的蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0

10、.01)。
　　結(jié)論：
　　1.過(guò)表達(dá)P4Hα1使LSS和OSS所誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞含量減少，膠原成分及纖維帽厚度增加，脂質(zhì)含量無(wú)明顯變化，增加斑塊的穩(wěn)定性;
　　2.過(guò)表達(dá)P4Hα1增加LSS和OSS所誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的大小，TGF-β1表達(dá)增加。
　?、?震蕩剪切力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞P4Hα1表達(dá)及對(duì)膠原代謝的作用
　　目的：
　　1.觀察震蕩剪切力刺激下血管平滑肌細(xì)胞P4Hα

11、1表達(dá)的變化;
　　2.研究震蕩剪切力刺激下P4Hα1調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞膠原代謝的作用;
　　3.探討JNK-FOXO1通路在震蕩剪切力對(duì)平滑肌細(xì)胞P4Hα1表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用。
　　方法：
　　1.人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)的培養(yǎng)
　　將新購(gòu)買的HASMCs細(xì)胞在無(wú)菌培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)至融合時(shí)，吸出瓶中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗兩遍，加入適量提前預(yù)熱的0.25％胰酶，于顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓粒狀時(shí)加入適量的完全培養(yǎng)

12、基，吹打細(xì)胞，將混合液移至離心管中，800rpm/分離心5分鐘，棄掉上清，將細(xì)胞懸液加入新的培養(yǎng)瓶中，充分混勻，置于5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
　　2.人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞剪切力干預(yù)
　　選取4-7代的HASMCs接種于包被有Ⅰ型鼠尾膠原高壓消毒過(guò)的載玻片上。細(xì)胞生長(zhǎng)至密度約90％時(shí)，在37℃，5％CO2的條件下給予人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞靜止培養(yǎng)或0±4dyne/cm2病理性震蕩剪切力刺激0、3、6、12、24小時(shí)，觀察

13、震蕩剪切力對(duì)平滑肌細(xì)胞中P4Hα1、膠原、FOXO1、JNK表達(dá)的影響，以進(jìn)行后續(xù)的進(jìn)一步研究。
　　3.P4Hα1基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的轉(zhuǎn)染
　　P4Hα1基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體及空載體均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物基因技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染步驟按照慢病毒轉(zhuǎn)染手冊(cè)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)換液，48小時(shí)后觀察熒光表達(dá)情況，評(píng)估慢病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果：
　　1.震蕩剪切力條件下人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞P4Hα1的表達(dá)下調(diào)
　　與對(duì)照

14、組比較，震蕩剪切力下調(diào)平滑肌細(xì)胞中P4Hα1 mRNA及蛋白的表達(dá)，震蕩剪切力刺激下P4Hα1的表達(dá)在6小時(shí)、12小時(shí)及24小時(shí)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中12小時(shí)下調(diào)最明顯。
　　2.震蕩剪切力下調(diào)平滑肌細(xì)胞collagenⅠ、collagenⅢ的表達(dá)
　　與靜止對(duì)照組相比，震蕩剪切力下調(diào)平滑肌細(xì)胞中collagenⅠ、collagenⅢ的表達(dá)，震蕩剪切力干預(yù)下collagenⅠ、collagenⅢ的表達(dá)在

15、6小時(shí)、12小時(shí)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.P4Hα1參與震蕩剪切力對(duì)平滑肌細(xì)胞膠原代謝的調(diào)節(jié)
　　震蕩剪切力干預(yù)下過(guò)表達(dá)P4Hα1增加膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示震蕩剪切力干預(yù)下P4Hα1參與對(duì)平滑肌細(xì)胞膠原代謝的調(diào)節(jié)。
　　4.震蕩剪切力干預(yù)下JNK信號(hào)通路參與平滑肌細(xì)胞P4Hα1的表達(dá)下調(diào)
　　Western Blotting結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，震蕩

16、剪切力干預(yù)下P-JNK/JNK的水平在3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　與靜止對(duì)照組比較，震蕩剪切力干預(yù)下HASMCs中FOXO1蛋白的表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)OXO1蛋白的表達(dá)在3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　JNK通路抑制劑SP600125預(yù)處理平滑肌細(xì)胞1小時(shí)，給予平滑肌細(xì)胞震蕩剪切力干預(yù)12小時(shí)，Western Blotting結(jié)果顯示:震蕩剪切力干預(yù)