聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在低剪切力誘導的動脈粥樣硬化中的作用及機制研究.pdf

1、論文Ⅰ
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在低剪切力誘導的人臍靜脈內皮細胞炎癥中的作用及機制研究
　　 研究背景及目的
　　 動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病，最先發(fā)生于血流動力學紊亂的血管分叉或狹窄的部位。局部血流變化與這種部位特異性密切相關，其中一個重要的因素是剪切力(WSS)。剪切力是血液在血管中流動時對血管內膜產生的一種摩擦力。剪切力的大小與血液流速成正比，比管腔半徑成反比。生理剪切力的大小介于0.5

2、-1.2Pa，小于0.5Pa或者大于1.2Pa分別稱為低剪切力和高剪切力。剪切力作用于內皮細胞能引起胞內各種信號轉導分子的激活，如蛋白激酶C(PKC)、絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)等。此外，低剪切力能夠促進促動脈硬化物質在管腔和管壁之間的轉運，因此能促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是一種高度保守的DNA結合蛋白。作為一種核酶，PARP-1參與了DNA損傷后的修復。一旦與損傷的DNA結合

3、，PARP-1會被激活并催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)裂解為尼克酰胺和ADP核糖，從而在DNA修復、基因轉錄、細胞周期、細胞死亡、染色體功能和遺傳穩(wěn)定性中發(fā)揮重要的作用。然而，PARP-1過度活化會引起細胞內NAD+和ATP的耗竭，導致細胞能量危機、細胞毒性和細胞死亡。研究證實氧化應激引起的PARP-1過度活化與各種疾病的發(fā)生密切相關，如內皮功能障礙、休克、糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化等。此外，作為核因子κB(NF-κB)的激活物

4、，PARP-1能夠調節(jié)各種關鍵炎癥因子的表達，如單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、細胞間粘附分子1(ICAM-1)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等。
　　 在以往研究的基礎上，我們提出如下假設:1）低剪切力能引起氧化應激并導致DNA損傷，從而激活PARP-1;2）PARP-1在低剪切力引起的炎癥反應中發(fā)揮了重要作用。
　　 本研究正是基于以上思路，擬應用低剪切力刺激人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）以驗證這一假說。旨在探

5、討PARP-1在低剪切力引起的臍靜脈內皮細胞炎癥反應中的作用和可能的機制，以期尋找到與低剪切力相關的炎癥性疾病的預防和治療靶點。
　　 材料與方法
　　 1.細胞培養(yǎng)及剪切力模型建立:
　　 本實驗采用內皮細胞培養(yǎng)基(ECM)培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)作為研究對象;低剪切力(0.4Pa)刺激以誘導臍靜脈內皮細胞發(fā)生炎癥反應，靜態(tài)狀態(tài)下培養(yǎng)的臍靜脈內皮細胞作為實驗對照。
　　 2.細胞內基因蛋白

6、表達的干預:
　　 采用PARP-1抑制劑ABT888或瞬時轉染PARP-1小干擾RNA片段的方式實現(xiàn)對臍靜脈細胞內PARP-1表達的干預;采用SP600125，SB203580和U0126抑制劑來抑制JNK、P38和ERK的活性。
　　 3.實時定量逆轉錄PCR(Real-timeRT-PCR):
　　 收集各組細胞，提取RNA，進行逆轉錄和實時定量PCR，檢測各組細胞中iNOS和ICAM-1mRNA的表達水平

7、。
　　 4.蛋白印跡(Westernblotting):
　　 收集各組細胞，提取蛋白，分別檢測ICAM-1、iNOS、PARP-1、PAR、nitrotyrosine、H2A-X、p-H2A-X、c-Jun、p-c-Jun、MAPKAPK-2、p-MAPKAPK-2、ERK、p-ERK、Sirt1、IκBα和p-p65等蛋白的表達水平。
　　 5.細胞免疫熒光:
　　 顯示細胞超氧陰離子的生成，細胞內

8、的NF-κBP65亞基的表達及轉位情況。
　　 6.分光光度法:
　　 收集各組細胞，使用相應試劑盒以檢測細胞內NAD+的水平和Sirt1的活性。
　　 7.彗星實驗(cometassay):
　　 收集各組細胞，檢測細胞DNA損傷程度。
　　 8.電泳遷移率檢測(EMSA):
　　 收集各組細胞，提取各組細胞核蛋白，檢測細胞內核轉錄因子NF-κB的活性。
　　 研究結果
　

9、　 1.低剪切力誘導臍靜脈內皮細胞內iNOS和ICAM-1mRNA和蛋白的表達具有時間依賴性:
　　 應用低剪切力(0.4Pa)刺激HUVECs0h、4h、8h、12h、16h、24h和36h，RT-PCR和蛋白印記結果顯示，與正常對照組相比，LSS能夠誘導HUVECs細胞內iNOS和ICAM-1的表達。在LSS刺激4h后，iNOSmRNA和蛋白表達開始升高;在LSS刺激12h后，iNOSmRNA和蛋白達到峰值，此時ICAM-

10、1mRNA和蛋白的表達也明顯升高。
　　 2.LSS刺激增加了臍靜脈內皮細胞中PARP-1的蛋白表達和活性:
　　 與正常對照組相比，LSS能夠顯著增加細胞中PARP-1蛋白的表達量，而PARP-1的siRNA可以下調PARP-1的表達;此外，LSS刺激能增加PARP-1的活性，即上調PAR的生成，加入PARP-1抑制劑ABT888或siRNA后，PAR的生成明顯減少。
　　 3.LSS刺激增加了細胞中超氧陰離子

11、(O2-)和3-NT的合成:
　　 為了顯示細胞內的氧化應激水平，我們檢測了細胞內超氧陰離子和硝基酪氨酸的合成。DHE染色和蛋白印記結果顯示，與正常對照組相比，LSS刺激下的HUVECs細胞，O2-的合成和3-NT的表達明顯增加。
　　 4.LSS刺激引起細胞DNA損傷:
　　 彗星實驗結果顯示，低剪切力刺激能顯著增加尾部DNA的含量，而靜態(tài)條件下尾部幾乎沒有DNA;此外，LSS還能增加細胞中p-H2A-X的表達

12、，說明了LSS刺激能誘導細胞DNA損傷。
　　 5.LSS能夠通過MEK/ERK通路激活PARP-1:
　　 與正常對照組相比，LSS能夠活化JNK、p38和ERK通路，增加其磷酸化蛋白的表達。應用SP600125、SB203580、U0126抑制劑能夠抑制JNK、p38、ERK的磷酸化，但是只有MEK/ERK抑制劑U0126能夠減少PAR的生成。
　　 6.抑制PARP-1能夠減少炎癥因子iNOS和ICAM-1

13、的表達:
　　 蛋白印跡結果顯示，與正常對照組相比，LSS刺激能夠顯著增加iNOS和ICAM-1的蛋白表達量;應用ABT888或siRNA抑制PARP-1后，炎癥因子的表達明顯減少。
　　 7.抑制PARP-1通過上調胞內NAD+的水平而上調Sirt1的活性:
　　 與正常對照組相比，LSS刺激能夠顯著減少細胞內NAD+的水平和Sirt1的活性;抑制PARP-1后，細胞內NAD+水平明顯升高，伴隨Sirt1活性的

14、增加，而其蛋白表達量沒有明顯變化。
　　 8.抑制PARP-1通過抑制NF-κB的核轉位和活性而減少炎癥因子的表達:
　　 免疫熒光結果顯示，靜息狀態(tài)下，NF-κB的亞單位p65主要存在于胞漿中，而LSS刺激能夠誘導p65亞基的核轉位;抑制PARP-1后，LSS誘導的p65亞基核轉位受到明顯抑制。EMSA結果顯示，LSS刺激能夠增加NF-κB的轉錄活性，而抑制PARP-1能夠顯著降低NF-κB的活性。此外，蛋白印跡結果顯

15、示，LSS能減少IkBα的表達，增加p65亞基的磷酸化;而抑制PARP-1能夠減少p65亞基的磷酸化，對IkBα的表達無顯著作用。
　　 結論及意義
　　 1.低剪切力能夠誘導人臍靜脈內皮細胞的炎癥反應;
　　 2.低剪切力能夠引起細胞內氧化應激和DNA損傷;
　　 3.低剪切力可以通過MEK/ERK途徑激活PARP-1;
　　 4.抑制PARP-1能夠減輕LSS誘導的臍靜脈內皮細胞炎癥反應，這一

16、作用主要通過以下兩個機制實現(xiàn):(1)上調胞內NAD+水平而增加Sirt1的活性;(2)抑制NF-κB的核轉位和活性，以及p65亞基的磷酸化。
　　 5.在本實驗研究中，我們對PARP-1在低剪切力誘導的人臍靜脈內皮細胞炎癥中的作用及其機制做了系統(tǒng)的闡述，相關結果提示聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1或許是治療動脈粥樣硬化疾病的靶基因。
　　 論文Ⅱ
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1基因干預對低剪切力誘導的動脈粥樣硬化斑塊形成

17、的作用及機制研究
　　 研究背景及目的
　　 在西方發(fā)達國家，動脈粥樣硬化性疾病依然是患病率和死亡率的首要原因。隨著我國人民生活水平的提高和飲食結構的改變，動脈粥樣硬化(AS)也成為我國人民的主要死亡原因。動脈粥樣硬化的發(fā)病是多因素的，深入的了解動脈粥樣硬化對其早期預防和治療具有重要的意義。
　　 動脈粥樣硬化通常被認為是一種系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病機制與許多經典的危險因素密切相關，如高血壓，高血脂，糖尿病和吸煙等。動

18、脈粥樣硬化斑塊好發(fā)于血管彎曲、分叉和分支部位，提示血流動力和血管形態(tài)在斑塊形成中發(fā)揮了重要的作用。許多體內體外實驗已經研究了血管中血流的狀態(tài)并尋找斑塊好發(fā)部位與血流動力學之間的可能聯(lián)系。隨著研究的不斷深入，剪切力在動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用日益受到重視。
　　 在平直血管中，血液在各處血管的流速是不一致的。在血管軸心處血液流速最快，越靠近血管壁流速越慢。流動的血液會與血管發(fā)生摩擦，這種摩擦會產生一種平行作用于血管內膜的力，稱為剪切

19、力(WSS)。剪切力是一種十分重要的血流動力，它能夠引起血管活性物質的釋放，改變基因的表達、細胞代謝和細胞形態(tài)等。
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是PARP家族中含量最多的一種高度保守的核蛋白。氧化應激引起的DNA損傷能夠激活PARP-1。在細胞核中，活化的PARP-1催化裂解NAD+為ADP核糖并將其轉移到靶蛋白上。在正常情況下，PARP-1參與了DNA損傷的修復;但是在病理條件下，PARP-1的過度活化會引起

20、細胞內NAD+和ATP的耗竭，導致細胞能量危機和功能障礙甚至死亡。大量研究證實PARP-1的過度激活與各種疾病的發(fā)生密切相關，如休克、心衰、缺血再灌注損傷和糖尿病等。
　　 在以往研究的基礎上，我們提出如下假設:1）在動脈粥樣硬化形成的早期，抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠延緩低剪切力誘導的動脈粥樣硬化斑塊形成;2）抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1減少低剪切力誘導的動脈粥樣硬化斑塊形成是通過抑制內皮細胞炎癥反應來實現(xiàn)的。
　　

21、 本研究正是基于以上思路，在小鼠體內設計實驗以驗證這一假說。旨在探討PARP-1在動脈粥樣硬化斑塊形成中的作用，以期為抑制斑塊形成、預防心血管急性事件的發(fā)生防治尋找新的契機和治療靶點。
　　 研究方法
　　 1.實驗動物:
　　 先將ApoE和PARP-1敲基因小鼠合籠繁殖得到ApoE+-PARP-1+/-小鼠，然后將ApoE+/-PARP-1+/-雜合子合籠繁殖，應用PCR鑒定其子代基因型，最后得到ApoE-

22、/-PARP-1-/-雙基因敲除小鼠。
　　 2.動物模型的建立:
　　 8周齡雄性ApoE和ApoE/PARP-1敲基因小鼠，采用高脂喂養(yǎng)+右側頸動脈套管的方法，構建動脈粥樣硬化模型;實驗動物共分為三組:對照組，ApoE敲基因小鼠胃飼生理鹽水;抑制劑組，ApoE敲基因小鼠胃飼PARP-1抑制劑ABT888;敲基因組，ApoE/PARP-1敲基因小鼠。
　　 3.聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的干預:
　　 采

23、用基因敲除和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1抑制劑ABT888降低PARP-1基因表達。
　　 4.心率和血壓:
　　 實驗結束后，應用無創(chuàng)方法檢測各組小鼠的心率和血壓。
　　 5.血脂參數(shù):
　　 實驗結束后，收集小鼠血清，檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平。
　　 6.H&E和油紅O染色:
　　 收集左側頸動脈和右側

24、頸動脈近心端，制備小鼠頸動脈切片，進行H&E和油紅O染色，分別顯示斑塊的大體結構和斑塊內脂質含量。
　　 7.免疫熒光檢測:
　　 制備小鼠頸動脈近心端切片，進行免疫熒光染色，檢測斑塊組織內炎性因子ICAM-1的表達情況。
　　 8.蛋白印跡:
　　 收集頸動脈近心端，提取蛋白，用于檢測組織內聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的蛋白及其活性、炎性因子ICAM-1的表達量。
　　 9.DHE染色:
　　

25、 收集小鼠頸動脈，制備頸動脈切片，用于檢測斑塊內超氧化物陰離子的生成量。
　　 研究結果
　　 1.各組小鼠的一般情況:
　　 實驗結束后，檢測各組小鼠心率、血壓和血脂水平，結果顯示各組小鼠心率、血壓、血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的濃度水平無顯著統(tǒng)計學差異。這些結果提示PARP-1基因干預抑制動脈粥樣硬化斑塊形成與血脂之間沒有直接關系。
　　 2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠減少低剪切力誘

26、導的頸動脈斑塊形成:
　　 實驗結束后，我們應用H&E和油紅O染色檢測各組小鼠頸動脈斑塊及脂質的形成情況。與正常對照組的生理剪切力（左側頸動脈）相比，低剪切力（右側近心端）明顯促進了動脈粥樣硬化斑塊和脂質的生成(p＜0.05，VS.生理剪切力)。與對照組低剪切力相比，PARP-1抑制或敲除明顯抑制了實驗組套管側近心端斑塊的形成和脂質的含量(p＜0.05，VS.對照組低剪切力)。
　　 3.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠

27、抑制低剪切力誘導的炎癥反應:
　　 實驗結束后，我們檢測小鼠頸動脈炎癥因子ICAM-1的表達情況。免疫熒光結果顯示，與生理剪切力（對照組左側頸動脈）相比，低剪切力（對照組套管近心端）能夠明顯促進ICAM-1的表達(p＜0.05，VS.生理剪切力);而在各實驗組中，PARP-1抑制或敲除能夠明顯抑制低剪切力誘導的ICAM-1表達(p＜0.05，VS.對照組低剪切力)。蛋白印跡顯示了類似的結果，且基因敲除引起的效果較抑制劑明顯。這些

28、結果說明抑制PARP-1減少低剪切力誘導的斑塊形成是通過抑制內皮細胞炎癥反應來實現(xiàn)的。
　　 4.低剪切力能夠增加聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表達和活性:
　　 實驗結束后，我們檢測了小鼠頸動脈中PARP-1和PAR的表達情況。蛋白印跡結果顯示，與生理剪切力（對照組左側頸動脈）相比較，低剪切力（對照組套管近心端）能夠明顯增加PARP-1和PAR的表達量(p＜0.05，VS.對照組生理剪切力)。在實驗組套管側近心端，抑制劑組

29、小鼠PARP-1的表達無明顯變化，而PAR的表達明顯下降;雙基因敲除組小鼠體內沒有PARP-1和PAR的表達(p＜0.05，VS.對照組低剪切力)。
　　 5.低剪切力能夠增加氧化應激反應:
　　 實驗結束后，我們應用DHE染色顯示組織中超氧陰離子的形成狀況。DHE染色結果顯示，與生理剪切力（對照組左側）相比，低剪切力（對照組套管近心端）能夠明顯增加組織超氧陰離子的生成，且PARP-1基因敲除或抑制對此沒有明顯影響。

30、r>　　 結論及意義
　　 1.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠減輕低剪切力誘導的動脈粥樣硬化斑塊形成;
　　 2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠減輕低剪切力誘導的內皮炎癥反應;
　　 3.低剪切力能夠增加聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表達和活性;
　　 4.低剪切力能夠增加氧化應激;
　　 5.該研究為進一步闡明PARP-1在AS斑塊形成中的作用和機理，從而為相關的心血管急性事件的防治提供新的思

31、路及有效的治療靶點。
　　 論文Ⅲ
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在高糖誘導的心肌細胞凋亡中的作用及機制研究
　　 研究背景及目的
　　 糖尿病(DM)是一種代謝綜合征，以機體相對或絕對胰島素不足或胰島素抵抗而出現(xiàn)高血糖為特征。據(jù)統(tǒng)計目前全球約有1億8千萬糖尿病患者，預計到2025年這一數(shù)字將增加到3億。隨著人民生活水平的改善和飲食結構的變化，我國糖尿病的患病率也達到了相當高的水平，大約是9.7％。

32、>　　 由冠狀動脈病變和高血壓引起的心血管疾病(CAD)是糖尿病患者死亡的首要病因。然而，科學研究發(fā)現(xiàn)在冠心病和高血壓等危險因素不存在的情況下，糖尿病患者也出現(xiàn)了心衰癥狀，臨床上將導致上述現(xiàn)象出現(xiàn)的疾病稱為糖尿病心肌病(DCM)。作為糖尿病的早期并發(fā)癥，糖尿病心肌病能夠導致心肌收縮和舒張功能異常。盡管糖尿病心肌病的發(fā)病機制仍然不明確，但是氧化應激在其中發(fā)揮了重要的作用。高血糖引起的氧化應激誘導微血管病變的發(fā)生，導致心肌細胞死亡、肥大、

33、纖維化和功能障礙。此外，氧化應激引起DNA鏈的斷裂并激活了聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP-1）。
　　 PARP-1是PARP家族中研究最為廣泛的一種核酶。PARP-1具有3個功能結構域:DNA結合結構域、自我修飾結構域和催化結構域。正常情況下，PARP-1參與了機體DNA損傷的修復和遺傳物質的穩(wěn)定。然而，當PARP-1被過度激活時，它會快速消耗胞內NAD以便將聚ADP核糖轉移到靶蛋白上。為了重新合成NAD，細胞會過度消耗A

34、TP，從而導致能量耗竭和細胞死亡。
　　 抑制PARP-1可以減少細胞能量消耗而減少細胞死亡。此外，最近研究顯示抑制PARP-1還能夠誘導Akt磷酸化，激活抗凋亡信號轉導通路。在心臟中，胰島素樣因子1(IGF-1)可以通過誘導胰島素樣因子1受體的磷酸化保護心臟功能，而后者的磷酸化能夠激活PI3K/Akt信號通路。
　　 在以往研究的基礎上，我們提出如下假設:1）抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠減少高糖誘導的心肌細胞凋亡;

35、2）抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1減少凋亡的作用是通過激活IGF-1R/Akt信號通路來實現(xiàn)的。
　　 本研究正是基于以上思路，我們設計了體外實驗以驗證這一假說。旨在探討聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在糖尿病心肌細胞凋亡中的作用和可能機制，以期尋找到糖尿病心肌病新的預防和治療靶點。
　　 材料與方法
　　 1.細胞培養(yǎng)及模型建立:
　　 應用DMEM培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細胞，以低糖(5.5mM)和高糖(33mM)

36、分別刺激細胞。
　　 2.基因和蛋白表達的干預:
　　 體外采用瞬時轉染PARP-1siRNA的方式抑制PARP-1的基因表達;分別應用IGF-1和PPP以促進或抑制IGF-1R的磷酸化水平。
　　 3.激光共聚焦顯微鏡:
　　 分別檢測大鼠心肌細胞內超氧陰離子(O2-)和活性氧簇(ROS)的含量。
　　 4.流式細胞術:
　　 檢測各刺激組心肌細胞的凋亡水平。
　　 5.實時定量

37、逆轉錄PCR(Real-timeRT-PCR):
　　 檢測大鼠心肌細胞中PARP-1的基因表達水平。
　　 6.蛋白印跡(westernblottinganalysis):
　　 分別檢測大鼠心肌細胞中PARP-1蛋白，IGF-1R和Akt蛋白的磷酸化水平。
　　 研究結果
　　 1.高糖誘導大鼠心肌細胞的氧化應激具有時間依賴性:
　　 應用高糖DMEM(33mM)分別刺激大鼠心肌細胞2

38、4h、36h和48h，應用DHE和DCF進行細胞染色，激光共聚焦顯微鏡拍片檢測細胞中超氧陰離子和ROS的生成水平。結果顯示，應用高糖刺激24h后，心肌細胞中的氧化應激水平與正常對照組(5.5mM)相當;應用高糖刺激36h，與正常對照組相比，超氧陰離子和ROS的生成分別增加了將近1倍和3倍(p＜0.05，VS.control);應用高糖刺激48h后，超氧陰離子和ROS的生成分別增加了將近3倍和4倍(p＜0.01，VS.control)。<

39、br>　　 2.高糖刺激增加了心肌細胞內PARP-1的表達和活性:
　　 分別應用高糖刺激心肌細胞24h、36h和48h后，檢測細胞中PARP-1的表達與活性水平。RT-PCR結果顯示，與正常對照相比，高糖刺激24h后PARP-1基因表達無明顯變化，高糖刺激36h和48h能夠明顯增加心肌細胞中PARP-1的基因表達量。蛋白印跡結果顯示，高糖刺激24h后PARP-1和PAR蛋白表達無明顯變化，高糖刺激36h和48h明顯增加了PA

40、RP-1和PAR蛋白的表達量，且呈現(xiàn)時間依賴性。這些結果顯示高糖能夠增加PARP-1的表達和活性。
　　 3.PARP-1siRNA減少了PARP-1基因和蛋白的表達量:
　　 實驗中我們應用了PARP-1的siRNA來抑制PARP-1的表達，并用RT-PCR和蛋白印跡的實驗方法檢測了干擾效率。RT-PCR結果顯示與正常對照相比，PARP-1siRNA明顯減少了PARP-1基因的表達;蛋白印跡結果顯示應用PARP-1si

41、RNA使PARP-1蛋白表達量減少到正常對照的一半。PARP-1siRNA的陰性對照對其基因和蛋白表達沒有明顯影響。這些結果顯示PARP-1siRNA能有效抑制PARP-1的表達。
　　 4.抑制PARP-1減少了高糖誘導的胞內NAD+消耗:
　　 一旦被DNA損傷激活，PARP-1就會以胞內NAD+為底物進行聚ADP核糖化反應。我們應用NAD檢測試劑盒測定各組細胞NAD+的水平。分光光度結果顯示與正常對照組相比，高糖能

42、夠明顯降低胞內NAD+的含量;而抑制PARP-1能夠減少高糖誘導的NAD+消耗。這些結果說明PARP-1參與了高糖誘導的胞內NAD+消耗。
　　 5.抑制PARP-1減少了高糖誘導的心肌細胞凋亡:
　　 隨后我們應用流式細胞術檢測了各種心肌細胞的凋亡狀況。結果顯示與正常對照相比，高糖能夠增加細胞的凋亡水平;應用IGF-1能夠減少高糖誘導的細胞凋亡，而PPP卻能夠增加高糖引起的細胞凋亡;抑制PARP-1后，高糖誘導的心肌細

43、胞凋亡水平明顯減少。這些結果顯示，與IGF-1一樣，抑制PARP-1也能夠減少心肌細胞凋亡。
　　 6.抑制PARP-1增加了Akt磷酸化水平:
　　 在接下來的實驗中，我們研究了抑制PARP-1減少細胞凋亡的可能機制?？紤]到Akt在抗凋亡中的重要作用，我們檢測了細胞中Akt的表達。蛋白印跡結果顯示，各組細胞總Akt的表達沒有明顯變化;但是與高糖刺激組相比，應用IGF-1和PARP-1siRNA能夠增加Akt的磷酸化水平

44、;應用PPP卻減少了磷酸化Akt的表達。這些結果顯示Akt參與了抗凋亡機制。
　　 7.抑制PARP-1增加了IGF-1R的磷酸化水平:
　　 隨后我們檢測了IGF-1R的表達量。蛋白印跡結果顯示，各組細胞總的IGF-1R表達沒有明顯變化;但是與高糖刺激組相比，應用PPP減少了磷酸化IGF-1R的表達，應用IGF-1和PARP-1siRNA卻能夠增加IGF-1R的磷酸化水平。這些結果顯示抑制PARP-1減少凋亡是通過激活