JNK1-2在剪切力介導(dǎo)下ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、腦卒中等常見心腦血管疾病的發(fā)生都與血液流動(dòng)時(shí)作用于血管的應(yīng)力密切相關(guān)。血液動(dòng)力學(xué)異常是動(dòng)脈硬化發(fā)生的重要成因之一。研究血液動(dòng)力學(xué)-尤其是血流剪切力與血管重構(gòu)之間的關(guān)系，對(duì)于闡明動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)病機(jī)制、探索新的疾病治療方法具有潛在的理論和應(yīng)用價(jià)值。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化形成是一個(gè)長(zhǎng)期的病理過程，其發(fā)病機(jī)制最主要的有脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說、血栓形成學(xué)說、單克隆學(xué)說和損傷反應(yīng)等學(xué)說。其病理生理表現(xiàn)包

2、括:血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、平滑肌細(xì)胞浸潤(rùn)增殖、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)等細(xì)胞外基質(zhì)沉積、斑塊形成等。近期研究認(rèn)為:上述諸因素并不能完全解釋為何血管彎曲處和分叉處以及血液反流或有梗阻的地方更易形成斑塊，血流動(dòng)力學(xué)因素在AS發(fā)生條件中具有主要的作用。因?yàn)檫@些部位的血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)是剪切力的幅度降低，方向紊亂。而在正常狀態(tài)下，體內(nèi)大動(dòng)脈中的血流剪切力在5～20dynes/cm2(dynes/cm2)，平均約為12dynes/cm2，血管內(nèi)皮細(xì)胞多呈規(guī)則的

3、梭形排列，其長(zhǎng)軸與血流方向平行，此時(shí)血流剪切力對(duì)血管內(nèi)膜起保護(hù)作用，阻抑動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)新生血管形成。而血流剪切力相對(duì)較高的區(qū)域不發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，這可能與高血流剪切力區(qū)eNOS的表達(dá)增多有關(guān)。大多數(shù)研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和血流剪切力關(guān)系的實(shí)驗(yàn)為臨床病例觀察或體外實(shí)驗(yàn)，Cheng C等學(xué)者應(yīng)用改進(jìn)的血管周圍剪切力誘發(fā)裝置(也被成為套管)在動(dòng)物體內(nèi)改變血流剪切力，對(duì)比研究了不同剪切力對(duì)載脂蛋白E(apolipoprotei

4、n E)基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的作用，發(fā)現(xiàn)低血流剪切力區(qū)及振蕩剪切力區(qū)所形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的性質(zhì)，認(rèn)為低血流剪切力斑塊與振蕩剪切力斑塊相比，含有更多的脂質(zhì)成分，而血管平滑肌細(xì)胞及膠原含量均少于振蕩剪切力斑塊;且在低剪切力區(qū)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊更容易形成缺乏血管平滑肌細(xì)胞的薄纖維帽。
　　 血管腔的內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)暴露在血流動(dòng)力學(xué)的剪切力中，內(nèi)皮細(xì)胞上的感受器能感受血流剪切力的變化，將這種機(jī)械刺激通過激活特定的信號(hào)通路調(diào)節(jié)不同基

5、因和蛋白質(zhì)的表達(dá)影響內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌的結(jié)構(gòu)和功能(如增殖、凋亡、遷移、通透性、結(jié)構(gòu)重塑以及基因表達(dá)等)，參與血管的重塑和疾病的發(fā)生。在人類已發(fā)現(xiàn)的518個(gè)蛋白激酶系統(tǒng)中，絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。MAPK主要包括ERKl/2、JNK、p38和BMK/ERK5這四條經(jīng)典途徑，廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖到凋亡的過程。其中JN

6、K(c-Jun NH2-terminal kinases)家族，因?yàn)樗鼘?duì)物理、化學(xué)和生理應(yīng)激刺激(如紫外線、滲透壓變化、感染、細(xì)胞因子等)感受敏感也被稱為應(yīng)激活化蛋白激(stress-activated-MAP kinases，SAPK)，是哺乳動(dòng)物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第三類MAPK家族。JNK在傳導(dǎo)胞外信號(hào)至核轉(zhuǎn)錄因子時(shí)起著重要作用，可以提高轉(zhuǎn)錄能力。JNK蛋白可由3個(gè)基因編碼，JNK1和NK2基因存在于多種組織，而JNK3基因局限于在腦、心臟、

7、睪丸中表達(dá)。JNK基因通過選擇性剪接而產(chǎn)生10種JNK形式，激活的方式分為小G蛋白依賴性途徑和小G蛋白非依賴性途徑。JNK通路已被證實(shí)可被層流剪切力激活，通過G蛋白、PI3K、Src以及MEKK1的上調(diào)JNK分子后結(jié)合AP-1等轉(zhuǎn)錄因子引起下游效應(yīng)分子MCP-1、IL-8、VCAM以及胞外基質(zhì)的代謝等變化在動(dòng)脈粥樣硬化形成中發(fā)揮作用。在給與JNK抑制劑SP60025的野生小鼠和JNK2-/-apoE-/-敲基因小鼠中均能觀察到動(dòng)脈粥樣硬

8、化斑塊形成明顯減少。這些都說明血流剪切力可以通過細(xì)胞感受器啟動(dòng)JNK通路調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。
　　 另一方面，早期動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的病理學(xué)特征被認(rèn)為是促炎因子激活后影響內(nèi)皮功能紊亂啟動(dòng)的炎癥反應(yīng)過程。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)剪切力通過JNK信號(hào)通路引起內(nèi)皮功能改變、粘附分子(VCAM、ICAM、P選擇素、E選擇素等)分泌、單核-巨噬細(xì)胞募集遷移、脂質(zhì)吞噬泡沫細(xì)胞生成等改變參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　

9、 但研究結(jié)果也不盡統(tǒng)一，有文獻(xiàn)報(bào)道JNK2-/-apoE-/-敲基因小鼠較apoE-/-敲基因小鼠雖斑塊明顯減少，但VCAM等分子表達(dá)無(wú)明顯差異，這與許多研究報(bào)道的JNK廣泛參與炎癥反應(yīng)不同一致，因此有待于進(jìn)一步的研究。且以往對(duì)剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化形成分子機(jī)制的研究大部分通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)M血流剪切力來完成，但不能完全復(fù)制體內(nèi)血流的生理狀態(tài)。因此，我們將對(duì)apoE-/-基因敲除小鼠實(shí)施頸動(dòng)脈套管術(shù)構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化斑塊動(dòng)物模型，人為造成頸

10、動(dòng)脈處低、高及振蕩剪切力血流區(qū)域，用于觀察不同剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化形成部位，大小及穩(wěn)定性的相互關(guān)系。重點(diǎn)研究JNK信號(hào)通路在這一過程中的作用，通過給與JNK抑制劑，分組觀察不同組別間、不同剪切力在動(dòng)脈粥樣硬化形成的過程中與炎癥反應(yīng)、脂肪沉積和膠原代謝之間的相互關(guān)系。明確JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路在不同剪切力介導(dǎo)下對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的調(diào)節(jié)機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化疾病的治療提供新的途徑。
　　 目的：
　　 1.構(gòu)建斑塊動(dòng)物模型，

11、人為改變apoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈血流剪切力，形成低、高、振蕩剪切力及生理剪切力四個(gè)部位。
　　 2.采用組織學(xué)和分子生物學(xué)方法，分組觀察JNK抑制劑在不同剪切力介導(dǎo)下對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用。
　　 3.進(jìn)一步探討JNK通路在不同血流剪切力介導(dǎo)下，引起的生物效應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程中的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物模型的構(gòu)建和分組:8周齡左右雄性apoE-/-小鼠84只(25-30g)，

12、0.08％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠。頸部正中皮膚切開，剝離右側(cè)頸部的腺體和肌肉，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，小心分離與之伴行的迷走神經(jīng)，將長(zhǎng)度為2mm、內(nèi)徑為0.3mm的硅膠管(小鼠頸動(dòng)脈直徑為0.5mm)套置于血管外周，2端固定套管，人為造成動(dòng)脈狹窄，改變此處血流速度，狹窄的近心端由于放置套管造成血液流動(dòng)相對(duì)緩慢為低剪切力;套管部位血流速度較快為高剪切力;狹窄的遠(yuǎn)心端為振蕩剪切力;對(duì)側(cè)為生理剪切力。套管放置后小鼠均改用高脂食

13、物喂養(yǎng)，應(yīng)用小鼠體表超聲技術(shù)測(cè)定不同部位血流的變化和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的過程。
　　 分組:apoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈套管1周后均給以高脂飲食(0.25％膽固醇+15％脂肪)，隨機(jī)分為2組，每組42只，根據(jù)參考文獻(xiàn)一組腹腔注射SP600125(JNK的抑制劑)0.2mg/kg/d，另外1組同等體積NS腹腔注射作為對(duì)照。套管術(shù)后10周處死，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈、心臟、肝臟、脾臟、腎臟，脂肪組織留取標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
　　 2.血

14、液學(xué)指標(biāo)檢測(cè):麻醉小鼠灌注血管前經(jīng)心尖取血靜置30分鐘自凝后2500rpm離心15分鐘，取上層血清，酶法檢測(cè)血清中總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平。
　　 3.病理組織學(xué)檢測(cè):
　　 (1)每組取15只進(jìn)行組織學(xué)標(biāo)本處理，分別取材近心端(低剪切力)、套管區(qū)(高剪切力)、遠(yuǎn)心端(振蕩剪切力)及對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈(生理剪切力)，標(biāo)本用OCT包埋，制作6μm冰

15、凍切片，連續(xù)切片20張。分別行HE染色(用于軟件分析斑塊的形態(tài)學(xué))、Masson染色(顯示膠原)、油紅0染色(顯示脂質(zhì))等染色分析各組成分。
　　 (2)免疫熒光檢測(cè):免疫熒光雙標(biāo)VCAM-1和vWF檢測(cè)重點(diǎn)觀察兩組間各不同剪切力部位內(nèi)皮表達(dá)VCAM-1的不同，闡明剪切力的變化與JNK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)與粘附分子之間的關(guān)系。
　　 (3)組織病理學(xué)測(cè)量:根據(jù)每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片的組織學(xué)染色結(jié)果，H&E染色后光鏡下攝片，用Imag

16、ePro-Plus軟件測(cè)量血管中層壁厚(MT)和管腔內(nèi)徑(LD)，每個(gè)標(biāo)本測(cè)量5次，取平均值，并計(jì)算二者的比值(MT/LD)。通過直線相關(guān)分析判定內(nèi)中膜厚度，管腔面積和血流剪切力的關(guān)系。使用圖象分析軟件IPP測(cè)量VCAM-1的熒光強(qiáng)度變化，比較不同部位的炎癥反應(yīng)程度。
　　 4.實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè):各組動(dòng)物取10只頸動(dòng)脈分段取材近心端(低剪切力)、套管區(qū)(高剪切力)、遠(yuǎn)心端(振蕩剪切力)及對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈(生理剪切力)

17、新鮮標(biāo)本，同組同側(cè)提取組織RNA，RT-PCR方法檢測(cè)ICAM-1，VCAM-1等的表達(dá)。
　　 5.Westernblot檢測(cè):取新鮮頸動(dòng)脈斑塊標(biāo)本，按實(shí)驗(yàn)分組分段提取蛋白，采用Westernblot方法檢測(cè)不同部位ICAM-1，VCAM-1，NFκB，JNK1/2的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.M型超聲成像評(píng)價(jià)和血脂水平檢測(cè)
　　 小動(dòng)物超聲M型超聲評(píng)價(jià)套管術(shù)后3天近心端(低剪切力區(qū))與對(duì)側(cè)頸動(dòng)

18、脈(生理剪切力)相比，血流速度(Vmax)明顯減低，根據(jù)公式SS=4μVmax/Ds計(jì)算所得的剪切力數(shù)值明顯低于生理剪切力(P＜0.05)。術(shù)前及取材時(shí)的血脂水平比較結(jié)果顯示，兩組TC及LDL這兩個(gè)主要的影響動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的指標(biāo)沒有明顯差別(P＞0.05)，說明JNK抑制劑SP600125對(duì)循環(huán)中的血脂水平?jīng)]有明顯影響，兩組間飲食中及血清中血脂水平無(wú)明顯差異。
　　 2.抑制JNK活性明顯減少LSS和OSS部位的動(dòng)脈粥樣硬化的

19、發(fā)生
　　 組織學(xué)切片過程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組(NS組)的LSS部位及OSS部位斑塊的發(fā)生率分別為100％和62.5％，兩部位比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而在HSS和對(duì)側(cè)USS部位均無(wú)斑塊發(fā)生。JNK抑制劑組LSS和OSS部位斑塊發(fā)生率均為13.3％，與同部位的NS組相比明顯降低(P＜0.05)。
　　 HE染色后測(cè)量頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜比值(I/M)結(jié)果顯示生理鹽水組LSS部位斑塊體積明顯大于OSS部位(1.21VS.0

20、.42;P＜0.05)，HSS及USS部位無(wú)明顯差異(P＞0.05)。JNK抑制劑組LSS及OSS部位與生理鹽水同部位相比明顯降低(0.02,0.07VS.0.42,1.21;P＜0.05)。
　　 3.抑制JNK活性后頸動(dòng)脈各剪切力部位斑塊成分的影響
　　 油紅0檢測(cè)脂質(zhì)含量的染色中發(fā)現(xiàn)，JNK抑制劑組各部位均無(wú)斑塊發(fā)生，故檢測(cè)到的脂質(zhì)含量均較生理鹽水組低(P＜0.05)，而在生理鹽水組LSS及OSS部位有明顯脂質(zhì)成分

21、(P＜0.05)，其中LSS部位較之OSS部位有更明顯的脂質(zhì)含量增高(45.53％VS.13.48％.P＜0.05)。
　　 MASSON染色觀察平滑肌與膠原含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑塊發(fā)生的兩個(gè)部位LSS及OSS比較，生理鹽水組中LSS較OSS部位膠原含量稍低及平滑肌含量稍高，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。JNK抑制劑組較生理鹽水組比較膠原含量稍有升高(24.41％VS17.62％.，P＞0.05)而平滑肌含量降低(21.24％V

22、S.26.17％，P＞0.05)，兩組并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.抑制JNK活性后明顯減少LSS及OSS引起的粘附分子等相關(guān)分子的表達(dá)
　　 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組中，與USS部位比較，VCAM-1表達(dá)明顯升高，LSS及OSS部位分別升高12.5倍和4.3倍(P＜0.05)，而HSS部位無(wú)明顯差異(P＞0.05)。JNK抑制劑明顯減少LSS和OSS引起的VCAM-1表達(dá)(P＜0.05)。West

23、ernBlot及免疫熒光檢測(cè)所得的VCAM-1蛋白表達(dá)結(jié)果均顯示，LSS及OSS部位有明顯升高(P＜0.05)，且LSS較之更高(P＜0.05)。而JNK抑制劑組VCAM-1表達(dá)均生理鹽水組較同一部位明顯降低(P＜0.05)。
　　 進(jìn)一步檢測(cè)SP600125對(duì)JNK的抑制率，WesternBlot顯示JNK抑制劑組各部位p-JNK表達(dá)均明顯降低(P＞0.05)。而且，與炎癥反應(yīng)明顯相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NFκB的活性成分p-p65的表

24、達(dá)量在JNK抑制劑組明顯低于同部位的生理鹽水對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.頸動(dòng)脈套管人為改變apoE-/-小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)不同血流剪切力后小動(dòng)物M型超聲測(cè)量低剪切數(shù)值，證實(shí)模型是成功的。
　　 2.LSS和OSS均促動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，且LSS的作用更明顯;而HSS及USS則顯示保護(hù)性作用。JNK抑制劑SP600125明顯減少LSS及OSS所誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　 3.抑制JNK基