白蠟屬雜交種組織培養(yǎng)及SA誘導(dǎo)香豆素合成技術(shù)研究.pdf

1、白蠟屬（Fraxinus）隸屬于木犀科(Oleceae)，共有70余種，主要分布在北半球，我國白蠟屬植物約有20余種，是很重要的闊葉用材樹木。近年來研究表明白蠟屬樹種富含多種香豆素類化合物，其中含量較多的是白蠟樹精和白蠟樹精-6-β-D-葡萄糖苷（Mandshurin），對于治療高血壓、抑制凝血、抗病毒感染、治療癌癥等有一定療效，在食品、化妝品等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。本文以白蠟屬種間雜種F1代為外植體進(jìn)行組織離體培養(yǎng)并對SA誘導(dǎo)香豆素

2、類化合物合成技術(shù)進(jìn)行了研究，所得結(jié)論如下:
　　(1)白蠟屬種間雜交子代微繁技術(shù)的研究:①在消毒方式上選擇使用10％次氯酸鈣消毒10～12min時，褐化率和污染率低，效果良好。②最佳腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:WPM+0.7mg/L NAA+0.1mg/L TDZ，啟動率為52.63％。③外植體的選擇:以腋芽、莖段和葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，其中莖段為最佳外植體，平均啟動率為69.5％，平均褐化率為14.77％。④暗培養(yǎng)有利于愈傷組織的誘導(dǎo):

3、經(jīng)過72h暗培養(yǎng)轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng)，8天后誘導(dǎo)率達(dá)到82.67％。⑤最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:WPM+1.5 mg/L NAA+0.1 mg/LTDZ，誘導(dǎo)率為86.7％;最佳繼代培養(yǎng)基:WPM+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ，增殖倍數(shù)達(dá)到4.18倍，褐化率為0％。
　　(2)白蠟屬種間雜交子代組織中次生代謝產(chǎn)物含量差異與調(diào)控技術(shù)研究:
　?、僖噪s交子代莖段為材料誘導(dǎo)愈傷組織，比較17個F1雜交組合無性系，8個誘

4、導(dǎo)率均在80.0％以上，最高的是137號和149號(100％)，最低的為195號(82.05％);比較雜交子代和親本間誘導(dǎo)率的差異，其中7個雜交予代的誘導(dǎo)率均高于親本，5個誘導(dǎo)率低于父母本雙方或一方;通過葉片和莖段的誘導(dǎo)率的綜合分析得到16號、149號、87號和58號誘導(dǎo)率明顯高于親本，為優(yōu)良雜交子代。②雜種F1代與母本之間三種香豆素類物質(zhì)含量比較，其中4個雜交組合（16、110、36和87號）白蠟樹精和mandshurin含量均高于母

5、本;4個組合（16、110、52和87號）香豆素含量高于母本;3個組合（16、110和87號）三種香豆素含量均高于母本;綜合誘導(dǎo)率和香豆素類物質(zhì)含量選出16號和87號為適于愈傷組織懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)香豆素類次生代謝產(chǎn)物的優(yōu)良雜交組合。
　　②水楊酸調(diào)控種間雜種懸浮愈傷組織中香豆素類物質(zhì)合成技術(shù):將篩選出的優(yōu)良雜交子代16號的愈傷組織在WPM液體培養(yǎng)基+0.66 mg/L NAA+0.042 mg/L TDZ中，經(jīng)過6代以上的轉(zhuǎn)接，建立穩(wěn)

6、定的懸浮培養(yǎng)體系，添加SA處理8，24，48，72，96h，進(jìn)行細(xì)胞生長、香豆素類化合物類含量測定。SA的加入明顯促進(jìn)了白蠟樹精和香豆素的含量及產(chǎn)量的增加，培養(yǎng)96h后添加100mg/L的SA處理72h細(xì)胞中香豆素類物質(zhì)的含量最高，白蠟樹精產(chǎn)量為0.2595mg、比對照提高了35.03％;香豆素產(chǎn)量為0.1124 mg/g、比對照提高了56.56％。
　　(3)不同組合生長調(diào)節(jié)劑對分化的影響:①以六組生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行分化誘導(dǎo)，愈傷組

7、織呈深綠致密狀，但未見不定芽形成;②以培養(yǎng)的愈傷組織塊為材料進(jìn)行了石蠟切片觀察，分別在培養(yǎng)7d、14d、21d和28d進(jìn)行取材，其中14d和21d的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)分生細(xì)胞團(tuán)，并伴隨維管組織結(jié)節(jié)形成;③六組生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)分化顯微觀察顯示，WPM+1.0mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ培養(yǎng)7d和WPM+0.5 mg/LNAA+0.2mg/L TDZ和WPM+0.5 mg/L NAA++0.3mg/L TDZ培養(yǎng)7-14

8、d的繼續(xù)脫分化成愈傷組織;在WPM+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L TDZ培養(yǎng)14d具有旺盛的分裂活動，排列密集等的分生細(xì)胞團(tuán)。WPM+0.5 mg/LNAA+0.4mg/LTDZ培養(yǎng)21d細(xì)胞活性強(qiáng)，形成維管組織結(jié)節(jié)和維管束等。④比較了不同生長調(diào)節(jié)劑組合對愈傷組織中內(nèi)源激素含量的變化，生長調(diào)節(jié)劑組合WPM+0.5 mg/L NAA+0.4mg/L TDZ顯示了高水平的GA3和IAA以及低水平的ABA，且分裂素/生長素＞1有