維生素C后處理對(duì)缺氧復(fù)氧條件下花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板活化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：實(shí)驗(yàn)室及臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)血小板活化在缺血再灌注過程中發(fā)揮重要作用，但是其機(jī)制仍不甚明確。有研究表明，缺血再灌注中發(fā)生的血小板活化與活性氧大量產(chǎn)生密切相關(guān)。維生素C（VC）是一種弱酸性維生素，具有強(qiáng)大的抗氧化作用，以往研究發(fā)現(xiàn)，維生素C能夠清除活性氧、減少血小板活化、減輕再灌注損傷，但其對(duì)離體缺氧復(fù)氧血小板的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察維生素C后處理對(duì)離體缺氧復(fù)氧血小板的作用并闡明其具體作用機(jī)制。
　　方法：研究對(duì)象為新鮮機(jī)采

2、健康人血小板原漿共67人份，血小板濃度為（960～1280）×109/L，由河北省血液中心提供。其納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)均嚴(yán)格按照國家獻(xiàn)血法的標(biāo)準(zhǔn)。用生理鹽水將血小板原漿稀釋為200×109/L以備用，于血小板采集后4小時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行血小板缺氧-復(fù)氧實(shí)驗(yàn)以選取最佳實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間，對(duì)血小板進(jìn)行不同缺氧或復(fù)氧時(shí)間處理并用全血電阻抗法檢測(cè)血小板聚集，誘導(dǎo)劑為花生四烯酸（AA0.5mmol/L），建立離體缺氧復(fù)氧血小板模型。選取三種不同抗氧化

3、劑（維生素C、褪黑素、普羅布考）進(jìn)行缺氧后處理，并分別制備成缺氧復(fù)氧組（A/R組）、藥物后處理組（C1-3組），考慮到維生素C的弱酸性同時(shí)設(shè)立鹽酸后處理組（HCl組，Ph值與VC組相同，均為3.24）。用全血電阻抗法檢測(cè)血小板聚集率及斜率以觀察不同抗氧化劑對(duì)血小板聚集率的影響。測(cè)定維生素C后處理組中血小板凋亡相關(guān)指標(biāo)，用倒置熒光顯微鏡檢測(cè)活性氧（ROS），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位（△ψm），Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Ba

4、x、Bcl-2、細(xì)胞色素C（cyto-C）、Caspase-9的表達(dá)。
　　數(shù)據(jù)采用 SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布時(shí)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不服從正態(tài)分布時(shí)采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距)表示，即 M(QR)。正態(tài)分布時(shí)采用單因素方差分析，不服從正態(tài)分布時(shí)組間比較采用多個(gè)相關(guān)樣本的秩和檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.不同缺氧或復(fù)氧時(shí)間對(duì)健康人血小板聚集率的影響
　

5、　1.1.不同缺氧時(shí)間對(duì)于血小板聚集率的影響
　　與未缺氧組相比，各缺氧組血小板聚集率及聚集斜率均有所升高，且缺氧20min組活化率最大。兩兩比較，發(fā)現(xiàn)缺氧20min組與5min組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而5min、10min、30min組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；
　　1.2.不同復(fù)氧時(shí)間對(duì)于血小板聚集率的影響
　　與未復(fù)氧組血小板相比，各復(fù)氧組血小板聚集率及聚集斜率均有所升高，且5min組活化率

6、最大，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；
　　2.三種抗氧化劑后處理對(duì)A/R時(shí)血小板聚集率的影響
　　2.1.維生素C對(duì)A/R時(shí)血小板聚集率的影響
　　與缺氧復(fù)氧組相比，1000μM維生素C處理組血小板聚集率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而10μM組、100μM組、HCl組與A/R組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。1000μM維生素C較10μM、100μM來說，血小板聚集抑制率最大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義（P＜0.05）；
　　2.2.褪黑素對(duì)A/R時(shí)血小板聚集率的影響
　　與缺氧復(fù)氧組相比，100μM褪黑素處理組血小板聚集率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而0.01μM組、1μM組與A/R組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。1000μM褪黑素較0.01μM、1μM來說，血小板聚集抑制率最大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而0.01μM組、1μM組不僅未表現(xiàn)出抑制作用反而呈現(xiàn)活化血小板作用；
　　2

8、.3.普羅布考對(duì)A/R時(shí)血小板聚集率的影響
　　與缺氧復(fù)氧組相比，100μM普羅布考處理組血小板聚集率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而1μM組、10μM組與A/R組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。100μM普羅布考較1μM、10μM來說，血小板聚集抑制率最大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　3.維生素C對(duì)血小板凋亡相關(guān)指標(biāo)變化影響
　　3.1.活性氧（ROS）
　　與Control組（指血

9、小板置于空氣中，未進(jìn)行缺氧復(fù)氧）相比，A/R組、VC組、HCl組中ROS產(chǎn)生明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與A/R組相比，VC組ROS減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而HCl組無類似變化，提示維生素C具有強(qiáng)大的清除活性氧的作用，且該作用與VC本身的弱酸性無關(guān)；
　　3.2.線粒體膜電位（△ψm）
　　與Control組相比，A/R組、VC組、HCl組中低△ψm血小板百分比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜

10、0.05）；VC組與A/R組相比，低△ψm血小板百分比相對(duì)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而HCl組與A/R組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示維生素C減輕線粒體損傷與其抗氧化作用相關(guān)，而與其酸性無關(guān)；
　　3.3.凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cyto-C、Caspase-9的表達(dá)
　　與Control組相比，A/R組、VC組、HCl組中cyto-C、Bax、Bcl-2、Caspase-9表達(dá)明顯增多，

11、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示缺氧后線粒體損傷，凋亡途徑激活。與A/R組相比，VC組cyto-C、Bax、Caspase-9表達(dá)減少，Bcl-2表達(dá)增多，凋亡程度減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而HCl組無此變化。提示維生素C可通過抑制血小板凋亡來降低血小板活化。
　　結(jié)論：
　　1.不同抗氧化劑均可濃度依賴性地抑制血小板活化聚集。
　　2.維生素C后處理通過清除ROS，下調(diào)cyto-C、Bax、Cas