細(xì)胞黏附分子L1與動力蛋白Dynamin1相互作用調(diào)控阿爾茲海默癥發(fā)病機(jī)制.pdf

1、背景：阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種持續(xù)性神經(jīng)退行性疾病。AD的病因主要是由于可溶性的單體淀粉樣蛋白β（amyloid beta，Aβ）片段聚集，導(dǎo)致原纖維沉積，最終形成淀粉樣斑塊。L1神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（L1 cell adhesion molecule，L1）是200-220 kDa跨膜糖蛋白，含有六個(gè)免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域和五個(gè)纖連蛋白III型重復(fù)，以及單通道跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（L1 intr

2、acellular domain，L1-ICD）。前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)L1在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)中過表達(dá)時(shí)，可顯著降低AD小鼠的病理癥狀，提示L1可能在緩解AD癥狀中具有重要的生物學(xué)功能。動力蛋白Dnm1（Dynamin1）是一種100 kDa的GTP水解酶，參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用與囊泡循環(huán)。先前的研究發(fā)現(xiàn)抑制Dnm1的表達(dá)可以顯著降低N2a-APP695細(xì)胞中的Aβ表達(dá)水平。表明Dnm1在AD進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。因此，我們推測L1可能與D

3、nm1通過組成蛋白質(zhì)復(fù)合體參與調(diào)控Aβ表達(dá)水平。研究L1和Dnm1在AD發(fā)病進(jìn)程中的相互作用，及其對Aβ表達(dá)水平的調(diào)控機(jī)制，可以為L1/Dnm1作為潛在的AD臨床治療手段提供理論依據(jù)。
　　目的：研究L1和Dnm1在AD病理過程中的相互作用。
　　方法：首先我們利用免疫共沉淀和質(zhì)譜分析推測可能與L1-ICD結(jié)合的分子，結(jié)果顯示在小鼠腦組織中，L1可能與Dnm1存在相互作用。我們進(jìn)一步利用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡分別檢測

4、兩者在HEB細(xì)胞和U-87 MG細(xì)胞中的表達(dá)定位情況。同時(shí)，我們利用免疫共沉淀技術(shù)和GST pull-down分別在體內(nèi)和體外驗(yàn)證L1與Dnm1的結(jié)合。為了表達(dá)GST-L1-ICD和Dnm1功能域重組蛋白，我們構(gòu)建了質(zhì)粒pET-32a-Dnm1-full-length，pET-32a-Dnm1-GTPase，pET-32a-Dnm1-MID，pET-32a-Dnm1-PH，pET-32a-Dnm1-GED，pET-32a-Dnm1-PR

5、D，以及pGEX-5X-1-L1-ICD，進(jìn)而在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出GST-L1-ICD，His-Dnm1-GTPase，His-Dnm1-MID，His-Dnm1-PH，His-Dnm1-GED，His-Dnm1-PRD，His-Dnm1-full length，隨后通過GST pull-down實(shí)驗(yàn)確定L1與Dnm1相互作用結(jié)構(gòu)域。之后我們利用免疫印跡檢測過表達(dá)Dnm1后N2a細(xì)胞中APP的表達(dá)水平。免疫組化試驗(yàn)檢測AD小鼠中L1與

6、Dnm1的變化情況。
　　結(jié)果：我們的研究結(jié)果顯示L1和Dnm1在神經(jīng)細(xì)胞中存在共定位。體內(nèi)和體外研究結(jié)果表明L1可以通過其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域直接與Dnm1相互作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Dnm1可以通過Dnm1-GTPase蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域直接與L1-ICD結(jié)合。在過表達(dá)Dnm1的N2a細(xì)胞中，可檢測到APP蛋白表達(dá)水平降低。與野生型相比，在AD小鼠海馬CA1區(qū)中L1蛋白水平升高，Dnm1水平降低。進(jìn)而L1和Dnm1可能組成一個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體在AD