胞質(zhì)動(dòng)力蛋白與牛皰疹病毒1型相互作用初步研究.pdf

1、牛皰疹病毒1型(BHV-1)屬皰疹病毒科，α皰疹病亞科成員，是有囊膜的雙鏈DNA病毒。病毒粒子由外向里分為4層：囊膜、被膜、衣殼和核酸芯髓。BHV-1基因組總共編碼70個(gè)左右基因，其中有10種為糖蛋白，6種為衣殼蛋白，15種為被膜蛋白。在長期的生物進(jìn)化過程中，α皰疹病毒一直經(jīng)由軸突微管逆行運(yùn)輸進(jìn)入核內(nèi)，最后在神經(jīng)元細(xì)胞體建立終身潛伏感染。
　　 胞質(zhì)動(dòng)力蛋白由2條重鏈、2條中間鏈、多個(gè)輕中間鏈和輕鏈組成，其中重鏈由一個(gè)基因編碼，

2、其它部分則由多個(gè)基因編碼。已有研究表明，HSV-1和PRV在侵染上皮細(xì)胞過程中，動(dòng)力蛋白會(huì)結(jié)合其病毒衣殼蛋白進(jìn)行運(yùn)輸。但是對BHV-1病毒粒子是否是依賴于微管進(jìn)入核內(nèi)沒有報(bào)道，同時(shí)，BHV-1在運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)過程中，病毒蛋白作用于動(dòng)力蛋白具體的亞基也是未知的。
　　 因此，本文主要對胞質(zhì)動(dòng)力蛋白結(jié)合BHV-1病毒粒子進(jìn)行初步研究，證實(shí)病毒進(jìn)入上皮細(xì)胞MDBK時(shí)是否依賴于微管，并且試圖找到與BHV-1相互作用的胞質(zhì)動(dòng)力蛋白亞基，為

3、精確探究皰疹病毒感染宿主細(xì)胞機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要工作包括：
　　 1.微管解聚藥物試驗(yàn)
　　 首先對細(xì)胞牛腎傳代細(xì)胞(MDBK)進(jìn)行微管解聚藥物Nocodazole最佳濃度摸索，得到的最適濃度為4μLg/mL，然后采用此濃度藥物作用于MDBK細(xì)胞，待藥物作用2h后吸棄并洗凈殘留藥物，用5MOI BHV-1野毒進(jìn)行感染，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，利用間接免疫熒光對病毒粒子進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位觀察。結(jié)果顯示微管解聚藥物Nocodazole

4、明顯引起細(xì)胞內(nèi)微管解聚，并且因此影響病毒進(jìn)入的數(shù)量。為了進(jìn)一步揭示病毒在藥物影響下增殖情況，我們通過生長曲線實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，用藥物處理細(xì)胞，在不同的時(shí)間點(diǎn)收毒，測定病毒PFU進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，藥物的作用延遲了病毒粒子進(jìn)入到核內(nèi)的時(shí)間；并且在較早的時(shí)間內(nèi)，用藥物處理的細(xì)胞中，由于微管的解聚導(dǎo)致重新聚合延遲，病毒粒子的增殖量較低。
　　 2.BHV-1病毒衣殼及被膜蛋白基因的克隆
　　 首先根據(jù)GenBank發(fā)表

5、的BHV-1全基因組序列找到病毒的衣殼及被膜蛋白基因序列，其中衣殼基因6個(gè)，被膜基因15個(gè)。分析各基因的序列，將較大的基因根據(jù)其抗原位點(diǎn)進(jìn)行截短，采取分段克隆。根據(jù)序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，利用BHV-1病毒基因組作為模板，利用PCR擴(kuò)增片段，回收并連接上pMD-18T載體，酶切驗(yàn)證并測序。利用生物信息學(xué)軟件比對測序結(jié)果，得到正確的質(zhì)粒，再將外源片段連接至pGAD-T7載體以備酵母雙雜交。最后得到正確的質(zhì)粒包括衣殼基因7個(gè)，被膜基因15個(gè)。<

6、br>　　 3.酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)
　　 將胞質(zhì)動(dòng)力蛋白連接pGBK-T7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌AH109并作為釣餌。首先檢測釣餌的自激活，其中Tctex1、Tctex3和C1I1-2連接pGBK-T7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后有自激活。將病毒蛋白基因轉(zhuǎn)化酵母菌Y187，利用酵母GAL4系統(tǒng)進(jìn)行酵母雙雜交，以SV40/53，SV40/Lam二倍體作為雜交陽性及陰性對照，最后通過篩選189對蛋白得到初步結(jié)果，其中輕鏈Robll與被膜蛋白UL51有較弱的相互