負(fù)壓對結(jié)核創(chuàng)面免疫相關(guān)信號軸及細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　通過成功構(gòu)建負(fù)壓調(diào)控MTB感染巨噬細(xì)胞的體外模型，篩選并檢測信號軸相關(guān)基因及巨噬細(xì)胞極化相關(guān)指標(biāo)，初步探索負(fù)壓調(diào)控對結(jié)核性創(chuàng)面免疫相關(guān)信號軸及巨噬細(xì)胞功能的影響，為結(jié)核性創(chuàng)面的治療提供新的思路和方法。
　　方法：
　　1、成功構(gòu)建負(fù)壓調(diào)控MTB感染巨噬細(xì)胞的體外模型。
　　2、利用高通量測序及生物信息學(xué)分析初步篩選結(jié)核創(chuàng)面免疫相關(guān)目的基因及負(fù)壓調(diào)控后免疫相關(guān)信號軸，并利用聚類分析篩選差異性表達(dá)的巨噬細(xì)

2、胞極化相關(guān)基因，初步探索負(fù)壓調(diào)控對MTB感染巨噬細(xì)胞功能的影響。
　　3、選擇PPD試驗陰性、家族中無結(jié)核病史的健康體檢者為對照組；選擇脊柱結(jié)核伴創(chuàng)面患者為感染組，經(jīng)VSD負(fù)壓治療30d后再次復(fù)查，并將其納入治療組。分別抽取上述人群的外周血，用Ficoll法分離外周血單個核細(xì)胞（PBMCs），提取RNA，利用RT-PCR技術(shù)驗證人體中目的基因A20及其相關(guān)信號軸基因的差異性表達(dá)。
　　4、體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，并

3、將其分為3組：對照組、MTB感染組、負(fù)壓治療組。至細(xì)胞生長對數(shù)期時，分別給予上述不同條件的干預(yù)，24h后消化、收集上述細(xì)胞，再次利用RT-PCR技術(shù)對目的基因A20及其相關(guān)信號軸基因的差異性表達(dá)進(jìn)行驗證。同時利用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測不同干預(yù)條件下巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD80、CD206的表達(dá)，以此來研究不同干預(yù)條件對巨噬細(xì)胞功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1、高通量測序篩選及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)基因A20相關(guān)信號通路基因呈顯著差

4、異性表達(dá)，且巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因IL-1、IL-6、IL-23、TNF-a較對照組呈顯著升高。
　　2、人外周血（PBMCs）及體外細(xì)胞實驗RT-PCR發(fā)現(xiàn)，A20-NF-kB呈負(fù)調(diào)控：
　　2.1.蛋白激酶在人外周血（PBMCs）中A20的表達(dá)量在感染組（4.05±0.17）較對照組（1.85±0.13）明顯偏高（P<0.05）；而NF-kB在感染組為（0.61±0.17）較對照組（1.13±0.37）卻明顯偏低（P<0.

5、05）。經(jīng)VSD負(fù)壓治療后，A20的表達(dá)量（2.36±0.21）較感染組（4.05±0.17）有所降低（P<0.05），相應(yīng)的NF-kB的表達(dá)量（0.81±0.21）較前（0.61±0.17）有所升高（P<0.05）。
　　2.2.在MTB感染RAW264.7細(xì)胞模型中A20的表達(dá)量感染組（6.92±0.21）低于對照組（9.75±0.33）；而NF-kB的表達(dá)量感染組（24.13±0.31）卻高于對照組（8.91±0.13），差

6、異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在負(fù)壓干預(yù)條件下，A20的表達(dá)量（5.57±0.17）比感染組更低（6.92±0.21），相應(yīng)的 NF-kB的表達(dá)量（33.41±0.17）比感染組（24.13±0.31）卻更高（P<0.05）。
　　3、MAlT1基因與A20呈同向變化：
　　在人外周血（PBMCs）中MALT1的表達(dá)量在感染組（5.01±0.09）較對照組（3.08±0.25）偏高（P<0.05），經(jīng)VSD負(fù)壓治療后，其表

7、達(dá)量（2.05±0.08）較感染組（5.01±0.09）有所降低（P<0.05）。在MTB感染RAW264.7細(xì)胞模型中MALT1的表達(dá)量感染組（6.53±0.28）低于對照組（8.41±0.37）；經(jīng)負(fù)壓干預(yù)后，MALT1的表達(dá)量（3.69±0.44）比感染組更低（6.53±0.28）（P<0.05）。
　　4、用FCM檢測巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志發(fā)現(xiàn)：MTB感染組 CD80呈顯著高表達(dá)（P<0.05），而經(jīng)負(fù)壓干預(yù)后CD80的表達(dá)量更

8、高（P<0.05）；而CD206的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、利用高通量測序及生物信息學(xué)初步預(yù)測了負(fù)壓對 A20相關(guān)信號軸及巨噬細(xì)胞極化功能的影響。
　　2、利用RT-PCR驗證了在人外周血（PBMCs）及體外細(xì)胞模型中A20-NF-kB呈負(fù)調(diào)控，與生物信息學(xué)篩查結(jié)果一致，且在人（PBMCs）及體外細(xì)胞模型中負(fù)壓調(diào)控均能降低A20、升高NF-kB。
　　3、而MALT1與A20呈