創(chuàng)面負(fù)壓治療對糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織TGF-β1的影響.pdf

1、目的：通過分析創(chuàng)面負(fù)壓治療前后和傳統(tǒng)紗布換藥治療前后糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)差異，探討創(chuàng)面負(fù)壓治療對糖尿病足肉芽組織TGF-β1的影響，為創(chuàng)面負(fù)壓治療促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面愈合提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.選取2013年11月至2015年3月間于解放軍白求恩國際和平醫(yī)院內(nèi)分泌科住院并符合入組標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病足患者40例。通

2、過計算機(jī)進(jìn)行完全隨機(jī)化分組將患者隨機(jī)分為創(chuàng)面負(fù)壓治療組（NPWT組）和傳統(tǒng)紗布換藥治療組（對照組），每組20例。
　　2.NPWT組予以創(chuàng)面負(fù)壓治療，對照組予以傳統(tǒng)紗布換藥治療。兩組受試者分別于治療前（0天）及治療第7天（7天）取創(chuàng)面肉芽組織，每份創(chuàng)面肉芽組織均分為三組，并分別標(biāo)記為A組、B組和C組。
　　3.A組取材后于4％多聚甲醛溶液中固定，4℃保存，標(biāo)本收齊后集中行蠟塊包埋保存。
　　4.取部分石蠟包埋的A組組織

3、，切片并行HE染色，于光學(xué)顯微鏡(400×)下觀察肉芽組織生長情況。
　　5.取部分石蠟包埋的A組組織，切片并行免疫組織化學(xué)染色，于光學(xué)顯微鏡(400×)下定性觀察TGF-β1表達(dá)情況，鏡下觀察棕黃色或棕褐色顆粒表示染色陽性。每個切片隨機(jī)選取5個視野拍照；用數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(MoticMedical6.0)對每個切片的5個隨機(jī)視野行光密度分析，平均光密度值(optical density,OD)表示每個切片TGF-β1含量，對

4、TGF-β1行定量分析。
　　6.B組于-80℃冰箱中保存，標(biāo)本收齊后行Western blot分析，β-actin為內(nèi)參照蛋白，Image J軟件分析條帶灰度。用TGF-β1與β-actin條帶灰度比值表示每個條帶TGF-β1含量，對TGF-β1蛋白表達(dá)行定量分析；
　　7.C組取材后活組織立即放入液氮中送實驗室于-80℃冰箱中保存，并立即行Real-time PCR。所有實驗過程在無RNA酶環(huán)境下行擴(kuò)增并對PCR行熒光定

5、量檢測。上游和下游引物對被設(shè)計為5′CCCACAACGAAATCT ATGACA3′和5′AGAGCAACACGGGTTCAG3′。GAPDH為內(nèi)參照基因，設(shè)置對照組的第1號樣品為標(biāo)準(zhǔn)1，得到各樣本各目的基因的Ct值。按照公式RQ=2-ΔΔCt計算各目的基因表達(dá)的相對定量值（RQ值），用RQ代表TGF-β1mRNA表達(dá)量并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1.肉眼觀察NPWT組和對照組治療前創(chuàng)面，見肉芽組織色澤晦暗，觸之發(fā)硬；

6、鏡下觀察兩組治療前創(chuàng)面HE染色切片，見新鮮肉芽組織少，成纖維細(xì)胞少，新生血管少，炎性細(xì)胞多。肉眼觀察治療NPWT組和對照組治療第7天創(chuàng)面，見新鮮肉芽組織形成，其中NPWT組較對照組新鮮肉芽組織形成明顯，表現(xiàn)為鮮紅色、顆粒狀，觸柔軟濕潤；鏡下觀察兩組治療第7天HE染色切片，可見新生肉芽組織，NPWT組較對照組明顯，表現(xiàn)為大量新生血管和大量成纖維細(xì)胞形成；
　　2.鏡下觀察經(jīng)免疫組織化學(xué)染色的切片，見NPWT組和對照組治療前創(chuàng)面肉芽組

7、織中代表TGF-β1陽性的棕黃色或棕褐色顆粒少，兩組治療后第7天創(chuàng)面肉芽組織中其中代表TGF-β1陽性的棕黃色或棕褐色顆粒增多，其中NPWT組較對照組更明顯。用平均光密度代表TGF-β1含量，對TGF-β1行定量分析：較治療前，治療第7天的NPWT組和對照組均存在創(chuàng)面肉芽組織TGF-β1表達(dá)上調(diào)（NPWT組t=8.250，p＜0.01,α=0.05；對照組t=3.204，p＜0.01,α=0.05），其中NPWT組TGF-β1上調(diào)較對照

8、組明顯（t=5.96，p＜0.01,α=0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義；
　　3.Western印跡分析顯示：較治療前，治療第7天的NPWT組和對照組均存在創(chuàng)面肉芽組織TGF-β1表達(dá)上調(diào)（NPWT組t=5.648，p＜0.01,α=0.05；對照組t=10.734，p＜0.01,α=0.05)，其中NPWT組TGF-β1上調(diào)較對照組明顯（t=9.62，p＜0.01,α=0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義；
　　4.RT-PCR分析TGF-

9、β1基因表達(dá)水平顯示，治療第7天的NPWT組和對照組肉芽組織均存在TGF-β1基因表達(dá)上調(diào)（NPWT組t=11.321，p＜0.01,α=0.05；對照組t=9.671，p＜0.01,α=0.05)，其中NPWT組TGF-β1基因表達(dá)上調(diào)較對照組明顯（t=8.02，p＜0.01,α=0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：創(chuàng)面負(fù)壓治療和傳統(tǒng)紗布換藥治療可在一定程度上促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面肉芽組織TGF-β1蛋白表達(dá)上調(diào)及基因表達(dá)上調(diào)，增加創(chuàng)