PDGFR-α在糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織中的表達(dá)研究.pdf

1、目的：糖尿病足是糖尿病患者嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)生的主要原因有血管病變、神經(jīng)病變、感染、下肢動(dòng)脈硬化缺血及局部微環(huán)境的異常等，常遷延不愈。目前導(dǎo)致其遷延不愈的機(jī)制尚不十分清楚。血小板源生長(zhǎng)因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）只有與其受體特異性結(jié)合后才能發(fā)揮其在創(chuàng)面愈合中的作用，本研究通過(guò)觀察糖尿病足創(chuàng)面和非糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織中血小板源生長(zhǎng)因子受體α（platelet derived growt

2、h factor receptorα，PDGFR-α）含量，進(jìn)一步探討糖尿病足創(chuàng)面遷延不愈的原因。
　　方法：
　　1.根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，選取2015年1月至2016年6月于白求恩國(guó)際和平醫(yī)院住院的糖尿病足潰瘍患者10例，非糖尿病足潰瘍患者10例，作為對(duì)照組。
　　2.兩組患者于入院后均給予常規(guī)清創(chuàng)處理，時(shí)間為10-15天。創(chuàng)面準(zhǔn)備完畢后取各組患者創(chuàng)面中的新鮮肉芽組織，并將取材的肉芽組織分為兩份。一份經(jīng)4％多聚甲

3、醛溶液固定后，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色觀察。另外一份取材后立刻放入液氮中，使其迅速冷卻，然后將組織標(biāo)本迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中儲(chǔ)存，用于Western blot分析和Real-time PCR檢測(cè)。
　　3.在光學(xué)顯微鏡下（400×）觀察兩組HE染色切片中肉芽組織形態(tài)，并在每個(gè)HE染色切片上隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中毛細(xì)血管數(shù)量，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，觀察創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)情況。
　　4.取上述石蠟切片進(jìn)行免

4、疫組織化學(xué)染色，對(duì)PDGFR-α表達(dá)情況進(jìn)行定量分析。首先在光學(xué)顯微鏡下（400×）對(duì)PDGFR-α表達(dá)情況進(jìn)行觀察，鏡下棕黃色或黃褐色顆粒代表PDGFR-α染色陽(yáng)性。在每個(gè)染色切片上隨機(jī)選擇10個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行拍照，用數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(MoticMedical6.0)對(duì)所選視野行PDGFR-α光密度值檢測(cè)，取平均光密度值(optical density, OD)，應(yīng)用平均光密度值對(duì)PDGFR-α進(jìn)行半定量分析。
　　5.應(yīng)用W

5、estern blot分析在蛋白水平觀察PDGFR-α表達(dá)情況。首先用Image J軟件分析兩組PDGFR-α條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照蛋白，結(jié)果以PDGFR-α與GAPDH條帶灰度的比值來(lái)表示每個(gè)條帶中PDGFR-α的相對(duì)表達(dá)量，對(duì)PDGFR-α進(jìn)行蛋白定量分析。
　　6.應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)在基因水平觀察PDGFR-α表達(dá)情況。對(duì)兩組創(chuàng)面肉芽組織進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，得到各目的基因表達(dá)相對(duì)定量

6、值，即PDGFR-αmRNA表達(dá)量，對(duì)PDGFR-α進(jìn)行基因定量分析。
　　結(jié)果：
　　1.肉芽組織觀察：肉眼觀察糖尿病足創(chuàng)面和非糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織，對(duì)照組肉芽組織新鮮，表現(xiàn)為肉芽組織鮮紅色，如顆粒樣生長(zhǎng)，觸感較濕潤(rùn)柔軟，取材時(shí)出血明顯。與對(duì)照組相比，糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織老化，表現(xiàn)為顆粒狀生長(zhǎng)不明顯，觸感較韌。
　　2.肉芽組織HE染色：在顯微鏡下觀察兩組HE染色切片，對(duì)照組創(chuàng)面肉芽組織可見(jiàn)毛細(xì)血管密集，大量成纖維

7、細(xì)胞增殖。與對(duì)照組相比，糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織毛細(xì)血管較稀疏，成纖維細(xì)胞數(shù)量較少。對(duì)平均毛細(xì)血管數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，糖尿病足組毛細(xì)血管數(shù)量較對(duì)照組明顯下降（P＜0.01）。
　　3.免疫組織化學(xué)染色切片鏡下觀察：兩組均可見(jiàn)PDGFR-α表達(dá)陽(yáng)性的棕黃色、黃褐色顆粒，其中對(duì)照組創(chuàng)面肉芽組織切片棕黃色顆粒數(shù)量較多，與對(duì)照組相比，糖尿病足組肉芽組織切片陽(yáng)性表達(dá)的棕黃色顆粒顯著減少。用平均光密度值代表PDGFR-α表達(dá)量，對(duì)PDGFR-α進(jìn)行

8、半定量分析，糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織PDGFR-α平均光密度值明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　4.Western blot分析結(jié)果顯示：統(tǒng)計(jì)兩組PDGFR-α與GAPDH條帶灰度的比值，對(duì)PDGFR-α表達(dá)情況進(jìn)行定量分析。對(duì)照組肉芽組織中PDGFR-α相對(duì)蛋白表達(dá)值是0.61±0.13，糖尿病足組肉芽組織中PDGFR-α相對(duì)蛋白表達(dá)值為0.33±0.10，糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織中PDGFR-α相對(duì)蛋白表達(dá)值低于對(duì)照組（P＜0

9、.01）。
　　5.Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：應(yīng)用PCR檢測(cè)兩組創(chuàng)面肉芽組織PDGFR-α基因表達(dá)情況，對(duì)PDGFR-α基因表達(dá)相對(duì)定量值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組肉芽組織中PDGFR-α相對(duì)基因表達(dá)值是1.32±0.49，糖尿病足組肉芽組織中PDGFR-α相對(duì)基因表達(dá)值為0.79±0.16，糖尿病足組創(chuàng)面肉芽組織PDGFR-αmRNA含量明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.對(duì)照組創(chuàng)面肉芽組織