不同頻率電針調(diào)控GSK-3β對AD大鼠腦內(nèi)Tau蛋白及神經(jīng)突觸可塑性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默?。ˋlzheimers’disease，AD）又稱老年性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要以損害大腦記憶和認(rèn)知功能為主，并伴有精神行為的異常。AD不僅給患者帶來巨大的痛苦，還給家庭和社會帶來了沉重的精神壓力和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。雖然目前關(guān)于 AD的致病假說層出不窮，例如膽堿能假說、鈣離子假說、能量與代謝假說、凋亡逃逸假說、β淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）病因假說等，但諸多假說卻始終未能明確

2、指出 AD的發(fā)病機(jī)制。因此，對 AD的防治及發(fā)病機(jī)制的研究已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，本研究從多角度探討不同頻率電針治療對 AD學(xué)習(xí)記憶功能的改善機(jī)制，進(jìn)一步評價(jià)和優(yōu)化針刺治療 AD的手段，提高臨床療效提供新的科學(xué)實(shí)踐依據(jù)。
　　方法與內(nèi)容：
　　選取SPF級Wistar雄性大鼠180只，4～5月齡，體重300～350 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，進(jìn)行 Morris水迷宮篩選，將篩選出的正常大鼠稱重后，隨機(jī)分為正常組、模型組、假

3、手術(shù)組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組、50 Hz電針治療組，共6組，每組30只。除正常組及假手術(shù)組外，其余4組均采用雙側(cè)腦室注射Aβ1-42制成AD模型，假手術(shù)組大鼠于雙側(cè)腦室注射5μL生理鹽水。注射2周后，對大鼠Morris水迷宮觀測以篩選造模成功大鼠。電針治療組在成功造模后立即開始實(shí)施電針刺激。針刺大鼠“百會”（頂骨正中）、“腎俞”（第2腰椎下兩旁）穴，百會接負(fù)極，腎俞接正極，左右側(cè)腎俞穴交替接電針。電針治療選用連續(xù)波，

4、電針頻率分別為2 Hz、30 Hz、50 Hz，電壓為2-4 V，電流為1 mA，統(tǒng)一留針20 min，每日1次，7日為1療程，療程間休息1日，共治療2個療程。正常組、假手術(shù)組及模型組每日以同樣方法進(jìn)行抓取。電針治療結(jié)束后，取 AD大鼠海馬組織采用透射電鏡及高爾基染色法觀察各組大鼠海馬區(qū)突觸外部形態(tài)和神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)變化。采用免疫熒光法組織化學(xué)法檢測各組大鼠腦海馬 Tau蛋白及各磷酸化位點(diǎn)表達(dá)水平。同時(shí)以Western blot檢測各組大鼠

5、大腦海馬及皮質(zhì)組織GSK-3β蛋白表達(dá)水平以及其抑制位點(diǎn) Ser-9、活性位點(diǎn) Tyr-216磷酸化表達(dá)水平，檢測各組大鼠腦海馬區(qū)、皮質(zhì)組織 Tau蛋白及各磷酸化位點(diǎn)磷酸化表達(dá)水平以及相關(guān)蛋白14-3-3δ、AMPA受體的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.不同頻率電針對大鼠腦海馬區(qū)的突觸外部形態(tài)、內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)和神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的影響
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：正常組和假手術(shù)組突觸形態(tài)較為清晰，能明顯觀察到突觸前膜、突觸后膜，突觸

6、間隙清晰可見，且前膜內(nèi)突觸囊泡豐富，分布密集，突觸膜結(jié)構(gòu)清晰、完整，可見雙層膜結(jié)構(gòu)；模型組突觸表現(xiàn)為突觸前膜和后膜界限模糊，突觸間隙不清晰，前膜內(nèi)突觸囊泡減少，分布不勻，突觸膜結(jié)構(gòu)不完整，發(fā)生溶解現(xiàn)象。3個電針治療組突觸形態(tài)較模型組改善，隨著電針頻率的升高，突觸前膜和后膜以及突觸間隙逐漸清晰，前膜內(nèi)突觸囊泡增加，分布致密度有所升高，神經(jīng)元胞體膜結(jié)構(gòu)也逐漸開始完整，膜溶解現(xiàn)象逐漸減少。且50 Hz電針治療組突觸的形態(tài)超微結(jié)構(gòu)較模型組優(yōu)于2

7、 Hz和30 Hz電針治療組。高爾基染色法對各組大鼠海馬區(qū)組織神經(jīng)纖維進(jìn)行染色的結(jié)果顯示：正常組和假手術(shù)組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)纖維清晰可見，離散分布；模型組可見大量的神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)；且2 Hz、30 Hz和50 Hz電針組中神經(jīng)纖維纏結(jié)情況得到改善，以50 Hz電針組的改善情況最為明顯。
　　2.不同頻率電針對大鼠腦海馬區(qū)及皮質(zhì)組織的 GSK-3β及其抑制性位點(diǎn)Ser-9、活性位點(diǎn)Tyr-216磷酸化水平的影響
　　模

8、型組動物的海馬區(qū) GSK-3β總蛋白明顯升高（P<0.05），Tyr-216位點(diǎn)磷酸化水平也顯著升高（P<0.05），且Ser-9位點(diǎn)磷酸化水平顯著下調(diào)（P<0.05）。3個治療組數(shù)據(jù)顯示，隨著電針頻率的升高，GSK-3β的總蛋白水平逐漸下降，Tyr-216位點(diǎn)磷酸化水平也呈下降趨勢，而 Ser-9位點(diǎn)磷酸化水平則呈上升的趨勢。50 Hz電針組GSK-3β總蛋白及其Tyr-216和Ser-9位點(diǎn)磷酸化水平均較模型組、2 Hz電針組和30

9、 Hz電針組具有顯著性差異（P<0.05）。皮質(zhì)組織檢測結(jié)果類似海馬區(qū)，AD模型組GSK-3β總蛋白和 Tyr-216位點(diǎn)磷酸化水平較正常組和假手術(shù)組升高， Ser-9位點(diǎn)磷酸化水平下調(diào)；且在不同頻率電針治療組，電針頻率越高， GSK-3β的 Ser-9位點(diǎn)磷酸化水平逐漸升高，而 GSK-3β總蛋白和 Tyr216位點(diǎn)磷酸化水平逐漸下調(diào)。50 Hz電針組GSK-3β總蛋白及其Tyr-216和Ser-9位點(diǎn)磷酸化水平均較模型組、2 Hz電

10、針組和30 Hz電針組具有顯著性差異（P<0.05）。
　　3.不同頻率電針對大鼠腦海馬區(qū)及皮質(zhì)組織 Tau蛋白各磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平以及相關(guān)蛋白14-3-3δ蛋白、AMPA受體表達(dá)的影響
　　模型組大鼠腦海馬區(qū) Tau蛋白水平明顯降低（P<0.05），Tau蛋白磷酸化水平明顯升高（P<0.05），S262位點(diǎn)和 S396位點(diǎn)磷酸化水平升高。與模型組比較，3組治療組的 Tau蛋白及其磷酸化（S262和S396）水平具有顯著

11、性差異（P<0.05），且較其他兩組（2Hz和30Hz電針治療組）50Hz電針治療組變化更明顯（P<0.05）。皮質(zhì)組織中的變化結(jié)果基本與腦海馬區(qū)變化結(jié)果一致。模型組大鼠腦海馬區(qū)的14-3-3δ蛋白顯著增加，而 AMPA受體蛋白則顯著下調(diào)（P<0.05）。在50 Hz電針治療組中14-3-3δ蛋白表達(dá)水平下降、AMPA受體蛋白的表達(dá)水平增加，與模型組和其他兩組電針治療組均具有顯著性差異（P<0.05）。但在大鼠的皮質(zhì)區(qū)，僅觀察到14-3

12、-3δ的表達(dá)水平呈相同趨勢，在AD模型組中顯著升高，而使用50 Hz電針治療后又顯著下降（P<0.05），AMPA受體蛋白水平則沒有顯著性差異變化。
　　結(jié)論：
　　1.電針能夠改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高AD大鼠海馬區(qū)突觸分布的密度，降低突觸間的彼此間隙，使神經(jīng)元胞體膜結(jié)構(gòu)更趨于完整化，優(yōu)化神經(jīng)信號傳導(dǎo)路徑，且50 Hz電針治療效果優(yōu)于2 Hz、30 Hz電針組。
　　2.電針能夠通過下調(diào) GSK-3β（Tyr-

13、216）表達(dá)，上調(diào) GSK-3β（Ser-9） 表達(dá)，抑制 Tau蛋白過度磷酸化，促進(jìn)突觸損傷修復(fù)，從而改善 AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，50 Hz電針治療效果優(yōu)于2 Hz、30 Hz電針組。
　　3.電針能夠通過下調(diào)14-3-3δ蛋白、上調(diào) AMPA受體蛋白的表達(dá)，通過調(diào)控 GSK-3β的活性，降低 Tau蛋白過度磷酸化，對突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，改善 AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，高頻電針治療效果優(yōu)于較低頻、中頻電針。
　　

14、4.不同頻率電針治療都能夠改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，且50 Hz電針的治療效果更好。這種治療效果可能是通過調(diào)控 GSK-3β蛋白及其磷酸化水平從而改善AD大鼠突觸形態(tài)可塑性損傷來實(shí)現(xiàn)的。
　　5.電針可能一方面通過改善 GSK-3β及其磷酸化的表達(dá)水平，改善AD大鼠突觸形態(tài)超微結(jié)構(gòu)的變化，從而改善神經(jīng)突觸的可塑性；另一方面通過調(diào)節(jié) GSK-3β的表達(dá)來調(diào)節(jié) Tau蛋白、其磷酸化水平以及其相關(guān)蛋白的表達(dá)水平來改善 AD大鼠突觸的功