抗Rab29多克隆抗體制備檢測與Rab29的細(xì)胞定位研究.pdf

1、[背景]
　　 Rab/Ypt/Sec4家族是RasGTP酶超家族中最大的一個(gè)分支蛋白家族。其在調(diào)控細(xì)胞生長、運(yùn)動、凋亡、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?。目前已?jīng)發(fā)現(xiàn)了超過70種Rab以及Rab-like蛋白。已經(jīng)研究過功能的有36種Rab蛋白。本文研究的hRab29蛋白還未被研究過。
　　 [目的]
　　 明確Rab29蛋白在細(xì)胞中的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位;確定Rab29分子在各個(gè)組織中的表達(dá)差異;制備和檢測Rab

2、29蛋白的多克隆抗體。
　　 [方法]
　　 1.運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建融合不同蛋白標(biāo)簽的Rab29野生型及突變型質(zhì)粒。如GFP-Rab29WT、pDmyc-Rab29WT、pDmyc-Rab29T21N、pDmyc-Rab29Q67L、GST-Rab29WT-羧基端。
　　 2.利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)和免疫熒光技術(shù)確定Rab29蛋白的定位。
　　 3.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)以及利用人不同組織cDNA文

3、庫,對Rab29進(jìn)行表達(dá)差異分析。
　　 4.運(yùn)用GST-beads提取純化Rab29抗原蛋白;利用抗原免疫家兔,制備Rab29抗體。
　　 5.運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)對制備抗體進(jìn)行檢測。
　　 [結(jié)果]
　　 1.構(gòu)建的各個(gè)融合標(biāo)簽Rab29質(zhì)粒測序正確。
　　 2.Rab29在所檢測的各個(gè)組織中均有表達(dá),其中在肝、胰、腎三種組織中表達(dá)量較高。
　　 3.

4、Rab29蛋白與高爾基體標(biāo)記蛋白TGN46、TGN38、GSl5、MANⅡ、GM130有良好的共定位。與其他細(xì)胞器諸如早期內(nèi)體、晚期內(nèi)體、溶酶體的標(biāo)記蛋白EEA1、LBPA、LAMP1沒有共定位。
　　 4.正確表達(dá)了抗原GST-Rab29WT-羧基端蛋白并成功免疫新西蘭大白兔;獲得約100mL抗體血清。
　　 5.成功檢測Rab29抗體的特異性。
　　 [結(jié)論]
　　 1.Rab29分子在機(jī)體各組織有普