半巢式全自動實時熒光定量PCR檢測在診斷肺內及肺外結核病應用價值研究.pdf

1、研究目的：
　　2011年，WHO推薦使用GeneXpert MTB/RIF試驗作為快速診斷活動期肺結核及利福平耐藥的方法，GeneXpert MTB/RIF試驗在涂陽肺結核的敏感度高于95％，涂陰肺結核的敏感度高于55％[1]。本研究的目的是評價GeneXpertMTB/RIF試驗在肺結核及肺外結核患者直接診斷結核分枝桿菌和利福平的耐藥性的應用價值。
　　研究方法：
　　第一部分:本研究是在山東省胸科醫(yī)院開展的，是山

2、東省唯一的一個省級防治結核病和其它肺部疾病的醫(yī)院。山東省是中國第二大省份，擁有9千6百萬的人口,其中59％的農村人口。山東省每年新發(fā)病例約4萬。本研究收集2013年7月到2014年6月在山東省胸科醫(yī)院住院治療的共506名疑似結核病患者的標本，包括疑似肺結核患者229名（痰標本229例），疑似肺外結核患者277名（101例腦脊液標本，124例胸腔積液標本，22例組織標本，21例尿液標本和9例腹腔積液標本），每例疑似結核病患者取3份標本，一

3、份采用熒光染色顯微鏡鏡檢;一份采用BACTECTMMGITTM960 Mycobacterial Detection System(BD，NJ，USA)進行結核菌快速培養(yǎng);一份用于GeneXpert MTB/RIF檢測。GeneXpert MTB/RIF檢測結果與金標準結核分枝桿菌培養(yǎng)結果及臨床診斷分別比較，評價GeneXpert MTB/RIF對痰液樣本及包括腦脊液、胸腔積液等肺外樣本中檢出結核分枝桿菌的敏感度和特異性。并以臨床診斷為

4、標準分別評估涂片熒光染色顯微鏡檢測、BACTECTM MGITTM960 MycobacterialDetection System結核菌快速培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測及三種方法聯(lián)合使用診斷結核病患者的敏感度。臨床診斷結核病主要通過臨床癥狀，胸部影像學表現(xiàn)，陽性的實驗室檢查（涂片顯微鏡檢查，結核分枝桿菌培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF試驗等）和經過抗結核試驗性治療好轉作為依據(jù)[3]。
　　第二部分:BAC

5、TECTM MGITTM960 Mycobacterial Detection System培養(yǎng)陽性的標本經涂片染色鏡檢確定為抗酸桿菌，使用結核分枝桿菌抗原MPT64試劑盒鑒定是否為結核分枝桿菌。經鑒定為結核分枝桿菌的樣本，采用BACTECTM MGITTM960Mycobacterial Detection System藥敏試劑盒進行藥物敏感試驗，主要包括2種一線抗結核藥物:異煙肼、利福平。使用標準菌株H37Rv作為質控菌株進行室內質

6、量控制。MGIT960液體藥敏結果與第一部分GeneXpert MTB/RIF檢測結果中利福平的藥敏檢測結果進行比對，評估GeneXpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的敏感度和特異性，及預測MDR-TB的敏感度和特異性;對于GeneXpert MTB/RIF檢測與結核分枝桿菌藥敏試驗(DST)檢測結果有差異的樣本提取DNA，應用焦磷酸測序的方法確認差異的菌株的基因型，評估GeneXpert MTB/RIF檢測ropB基因突變的準確性

7、。所有的檢測都在山東省胸科醫(yī)院漢光微生物實驗室（通過IS015189醫(yī)學實驗室認可的結核病檢測實驗室）內進行。
　　研究結果：
　　第一部分:229名疑似肺結核患者中，GeneXpert MTB/RIF檢測結果為130例(56.8％)結核分枝桿菌陽性，98例(42.8％)結核分枝桿菌陰性，還有1例不明確;結核分枝桿菌培養(yǎng)結果為125例（54.6％)結核分枝桿菌陽性，88例（38.4％)結核分枝桿菌培養(yǎng)陰性，10例（4.4％)

8、為非結核性分枝桿菌，6例（2.6％)為標本污染;熒光染色涂片鏡檢結果為128例(55.9％)陽性，101例(44.1％)陰性。GeneXpert MTB/RIF試驗和結核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性一致率為94.3％(k=0.885;95％ CI，0.824-0.946);GeneXpert MTB/RIF試驗和熒光染色涂片鏡檢陽性的一致率為75.1％(k=0.751;95％ CI，0.665-0.838)。
　　在277名疑似肺外結核患者

9、當中， GeneXpert MTB/RIF檢測結果為40例(14.4％)結核分枝桿菌陽性，237例(85.6％)結核分枝桿菌陰性;結核分枝桿菌培養(yǎng)結果50例(18.1％)結核分枝桿菌陽性，227例(81.9％)結核分枝桿菌培養(yǎng)陰性，未檢出非結核分枝桿菌;熒光染色涂片鏡檢結果只有11例(4.0％)陽性，266例(96％)陰性。GeneXpert MTB/RIF試驗和結核分枝桿菌培養(yǎng)兩種方法在尿液標本中有較高的一致率(n=2;100％; k

10、=1.0)，在組織標本中陽性一致率比較低(n=11;54.6％，k=0.091)。共有210名疑似肺外結核患者被臨床診斷為活動性結核病例，以臨床診斷為標準，GeneXpert MTB/RIF試驗、結核分枝桿菌快速培養(yǎng)、熒光染色涂片顯微鏡檢查及三者相結合的方法的敏感度分別是19.0％(40/210)、23.8％(50/210)、5.2％(11/210)和34.3％(72/210)。不同種類的標本GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感

11、度相差比較大（12.3％-61.1％），但是GeneXpert MTB/RIF試驗對于肺結核和肺外結核的診斷特異性均為100％.
　　第二部分:121例肺結核和肺外結核分離菌株進行了DST檢測。GeneXpertMTB/RIF檢測出21例利福平耐藥，DST檢測22例利福平耐藥，其中17例也存在異煙肼耐藥，即多重耐藥(MDR)， GeneXpert MTB/RIF試驗和DST檢測利福平耐藥的一致率是92.6％(k=0.746和95％

12、 CI，0.588-0.903)。以DST作為標準，GeneXpert MTB/RIF試驗檢測利福平耐藥的敏感度為77.2％和特異性為96.0％，在預測MDR-TB方面敏感度為76.5％(13/17)，特異性為96.2％(100/104)(Table3)。GeneXpert MTB/RIF試驗和結核菌藥敏檢測利福平耐藥不一致的有9例，GeneXpert MTB/RIF試驗檢測利福平耐藥而DST檢測敏感有4例， GeneXpertMTB/

13、RIF試驗檢測利福平敏感而DST檢測耐藥有5例，焦磷酸測序結果GeneXpertMTB/RIF試驗檢測利福平耐藥的4例樣本存在基因突變， GeneXpert MTB/RIF試驗檢測利福平敏感的5例樣本均未檢測到突變，GeneXpert MTB/RIF試驗檢測結果與焦磷酸測序結果一致。
　　研究結論：
　　GeneXpert MTB/RIF試驗對肺結核病的診斷有具有較好的敏感度和特異性，以臨床診斷為標準診斷肺結核病的敏感度為6

14、7.7％，特異性為100％，以結核菌培養(yǎng)為標準診斷肺結核病的敏感度為96.8％，特異性93.8％，陽性預測值與陰性預測值都達到了95％以上。對于肺結核病患者來說GeneXpert MTB/RIF試驗檢測時間短，操作簡單，與結核菌培養(yǎng)的一致性高于涂片鏡檢，而且可以排除非結核分枝桿菌(NTM)感染，對于肺結核病的診斷具有很好的應用價值。
　　對于肺外結核的病例研究發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌培養(yǎng)的敏感度要高于GeneXpertMTB/RIF試驗

15、(23.8％ vs.19％.0)，遠高于涂片鏡檢(5.2％)，三種方法聯(lián)合使用敏感度可達到34.3％，表明GeneXpert MTB/RIF試驗單獨用于診斷肺外結核病會導致檢出率偏低，容易漏診部分病人，同時進行結核菌快速培養(yǎng)和涂片熒光染色鏡檢檢測，三種方法聯(lián)合使用才能有效診斷肺外結核，不至于導致誤診或漏診。不同的肺外樣本GeneXpert MTB/RIF試驗敏感度相差較大，對于組織樣本GeneXpertMTB/RIF試驗敏感度遠高于其他

16、兩種方法，與其他兩種方法相比GeneXpertMTB/RIF試驗更適合于組織樣本檢測。
　　BACTECTM MGITTM960 Mycobacterial Detection System藥敏實驗和GeneXpertMTB/RIF檢測利福平藥敏的樣本共121例，其中MDR17例，占總數(shù)的14.05％，高于第五次全國流行病學調查報告報道的全國平均水平6.8％[4]。其中GeneXpertMTB/RIF檢測利福平耐藥的為21例，其中

17、13例為MDR，檢測為敏感的100例，其中包括4例MGITTM960藥敏檢測為MDR的菌株。以MGITTM960藥敏作為金標準GeneXpert MTB/RIF檢測利福平的敏感度為77.27％，特異性為95.96％，GeneXpert MTB/RIF試驗檢出76.5％(13/17) MDR-TB，低于部分國家學者報道GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度。有研究報道在結核病流行的國家混合型的結核分枝桿菌感染占結核病例的50％，病