青娥方含藥血清對離體兔脊柱運(yùn)節(jié)段壓力退變模型的影響.pdf

1、研究背景：
　　椎間盤退變與下腰痛有很大的聯(lián)系。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)早期治療與未病先防，對腰椎間盤退變等慢性病、難治病有其獨(dú)特的優(yōu)勢，其中補(bǔ)腎活血法是治療椎間盤退行性疾病的常用方法之一?；谘甸g盤退變機(jī)理，并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，以腎虛血瘀立法，根據(jù)古方青娥丸加減形成的青娥方，在臨床治療相關(guān)疾病中取得了較好的療效。但目前該方的作用機(jī)理還不明晰，對該方的臨床應(yīng)用尚缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的支持，故有必要對其作用機(jī)制進(jìn)行研究，為該方以及補(bǔ)腎活血法治療椎間盤

2、退行性疾病提供依據(jù)。
　　然而中醫(yī)藥成分眾多、作用復(fù)雜，再結(jié)合研究對象體內(nèi)代謝及環(huán)境差異等因素，使我們難以全方位的深入探明其機(jī)制，如何排除多種因素的干擾，明確中醫(yī)藥對該類疾病的作用，是我們面臨的挑戰(zhàn);同時為了更好的防治該類疾病，還需詳細(xì)了解椎間盤的退變機(jī)理，其中生物力學(xué)與椎間盤退變關(guān)系密切，因此有必要探究生物力學(xué)與椎間盤之間的聯(lián)系及作用，而構(gòu)建理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯ρ芯孔甸g盤退變的發(fā)病機(jī)制和臨床干預(yù)有著重要的意義。
　　目前椎間盤

3、退變模型主要分為體內(nèi)模型和體外模型兩大類，體外模型又分為離體培養(yǎng)的細(xì)胞和器官模型。將完整的椎間盤器官在體外進(jìn)行整體培養(yǎng)，能夠在可控的條件下研究椎間盤代謝和退變的相關(guān)機(jī)制，為觀察椎間盤對外界刺激的反應(yīng)和正常與退變椎間盤的組織學(xué)變化創(chuàng)造了良好的實(shí)驗(yàn)平臺。在此基礎(chǔ)上，相關(guān)研究離體培養(yǎng)了脊柱運(yùn)動節(jié)段模型，包括整個椎間盤器官連同椎體，使模型一方面更接近體內(nèi)環(huán)境，另一方面為加載裝置提供了固定的施力處，為控制和研究生物力學(xué)對椎間盤的影響提供條件。本研

4、究將脊柱運(yùn)動節(jié)段與生物力學(xué)相結(jié)合，為觀察生物力學(xué)與椎間盤的關(guān)系，以及研究中藥防治椎間盤退變的機(jī)制提供更好的實(shí)驗(yàn)平臺。
　　研究目的:
　　1.觀察青娥方治療椎間盤源性腰痛的臨床療效;
　　2.比較離體培養(yǎng)的兔椎間盤器官及脊柱運(yùn)動節(jié)段兩種模型椎間盤髓核組織的變化，為研究生物力學(xué)對椎間盤的影響提供條件;
　　3.建立離體兔脊柱運(yùn)動節(jié)段壓力退變模型，研究靜態(tài)壓力負(fù)荷對椎間盤的影響，并為進(jìn)一步研究中藥防治椎間盤退變提供條

5、件;
　　4.觀察青娥方含藥血清對離體兔脊柱運(yùn)動節(jié)段壓力退變模型的影響，初步探討其作用機(jī)制，為補(bǔ)腎活血法治療椎間盤退行性疾病提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.對43例椎間盤源性腰痛患者使用青娥方治療，日一劑，早晚口服，連續(xù)服用2周，于治療前、治療第1周、治療第2周、療程結(jié)束后1個月隨訪時進(jìn)行VAS與ODI評分，觀察臨床癥狀，判定療效;
　　2.將21只新西蘭白兔隨機(jī)分為器官組8只，節(jié)段組13只，處死后在無菌條件

6、下分別取出椎間盤器官和脊柱運(yùn)動節(jié)段各50個，在高滲培養(yǎng)基中進(jìn)行整體培養(yǎng)(410mOsm/kg)，于培養(yǎng)前及培養(yǎng)后第3、7、14、21天，兩組各取10個椎間盤分別進(jìn)行HE染色、蛋白多糖特染、Ⅱ型膠原免疫組化和髓核細(xì)胞活力測定。
　　3.將14只新西蘭白兔隨機(jī)分為對照組與壓力組各7只，處死后在無菌條件下分別取出脊柱運(yùn)動節(jié)段各28個，對照組放入六孔板中，壓力組放入脊柱運(yùn)動節(jié)段離體加載和培養(yǎng)裝置中，在高滲培養(yǎng)基中進(jìn)行整體培養(yǎng)，兩組培養(yǎng)液中

7、均含有10％無藥血清，于培養(yǎng)前及培養(yǎng)后第3、7、14天，兩組各取7個椎間盤分別進(jìn)行HE染色、蛋白多糖特染、Ⅱ型膠原免疫組化和Real-time PCR檢測。
　　4.將14只新西蘭白兔隨機(jī)分為壓力組與含藥組各7只，處死后在無菌條件下分別取出脊柱運(yùn)動節(jié)段各28個，均放入脊柱運(yùn)動節(jié)段離體加載和培養(yǎng)裝置中，在高滲培養(yǎng)基中進(jìn)行整體培養(yǎng)，其中含藥組與壓力組培養(yǎng)液中分別含有10％青娥方含藥血清與10％無藥血清，于培養(yǎng)前及培養(yǎng)后第3、7、14天

8、，兩組各取7個椎間盤分別進(jìn)行HE染色、蛋白多糖特染、Ⅱ型膠原免疫組化和Real-time PCR檢測。
　　研究結(jié)果:
　　1.43例患者治療第1周有效率為86.04％，治療第2周及隨訪時有效率為90.69％;治療第1周、第2周與隨訪時的VAS及ODI評分均與治療前有明顯差異(P＜0.001)，治療第2周、隨訪時的VAS及ODI評分與治療第1周也有差異(P＜0.05)，但治療第2周與隨訪時的VAS及ODI評分差異無統(tǒng)計(jì)意義(

9、P＞0.05);
　　2.培養(yǎng)21d器官組與培養(yǎng)14d節(jié)段組HE示椎間盤組織結(jié)構(gòu)基本保持完整，21d節(jié)段組椎間盤組織形態(tài)學(xué)破壞;蛋白多糖PAS/AB染色7d內(nèi)兩組強(qiáng)度無降低，14d兩組強(qiáng)度均有所減弱，21d節(jié)段組染色強(qiáng)度進(jìn)一步減弱，改變比器官組更為明顯;21d器官組與14d節(jié)段組Ⅱ型膠原免疫組化染色強(qiáng)度無顯著差異(P＞0.05)，21d節(jié)段組染色變淺，與之前各時間點(diǎn)及器官組相比有顯著差異(P＜0.05);髓核細(xì)胞熒光檢測兩組7d時

10、強(qiáng)度較培養(yǎng)前變化不明顯(P＞0.05)，21d器官組與14d節(jié)段組強(qiáng)度略有降低，但與之前時間點(diǎn)比較無顯著差異(P＞0.05)，21d節(jié)段組髓核細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞活性降低，與之前各時間點(diǎn)及器官組比較差異明顯(P＜0.05)。
　　3.對照組培養(yǎng)至14d形態(tài)基本維持良好，壓力組3d后形態(tài)完整性逐漸被破壞;蛋白多糖含量對照組7d時降低，壓力組3d時就顯著降低，并且分布不均勻;Ⅱ型膠原含量對照組始終較穩(wěn)定無明顯變化(P＞0.05)，壓

11、力組3d時出現(xiàn)明顯升高，與培養(yǎng)前及對照組相比差異顯著(P＜0.05)，7d時又明顯降低，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，14d時與7d無明顯差異(P＞0.05)，與對照組差異顯著(P＜0.01);Real time-PCR檢測Agg的基因表達(dá)顯示，與培養(yǎng)前比對照組3d時無明顯變化(P＞0.05)，7d與14d降低與培養(yǎng)前相比有明顯差異(P＜0.05)，壓力組3d時便顯著下降(P＜0.05)，7d與14d進(jìn)一步下降，與對照組差異明顯

12、(P＜0.01); COL2a1的基因表達(dá)顯示對照組較培養(yǎng)前表達(dá)下降(P＜0.05)，但培養(yǎng)期間表達(dá)水平較穩(wěn)定(P＞0.05)，而壓力組3d時表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，與對照組比有顯著差異(P＜0.01)，7d時表達(dá)又明顯下調(diào)(P＜0.05)，與培養(yǎng)前及對照組相比差異顯著(P＜0.05)，14d與7d相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但與對照組比有明顯差異(P＜0.01)。
　　4.壓力組3d后形態(tài)完整性逐漸被破壞，含藥組培養(yǎng)

13、至7d形態(tài)基本維持良好，14d時形態(tài)破壞與壓力組相似;蛋白多糖含量壓力組3d時就顯著降低，7d后下降更明顯，且分布不均勻，含藥組3d時著色強(qiáng)度部分減弱，7d與14d也均明顯減弱，提示蛋白多糖含量減少;Ⅱ型膠原含量壓力組與含藥組3d時均出現(xiàn)明顯升高(P＜0.05)，且含藥組更加顯著(P＜0.05)，7d時又均明顯降低(P＜0.05)，但含藥組仍比壓力組含量高(P＜0.05)，14d兩組則反應(yīng)均較弱無明顯差異(P＞0.05);Real ti

14、me-PCR檢測Agg的基因表達(dá)顯示，與培養(yǎng)前比兩組3d時便顯著下降(P＜0.05)，但與壓力組相比含藥組表達(dá)明顯(P＜0.01)，7d與14d表達(dá)進(jìn)一步下降(P＜0.05)，兩組之間無明顯差異(P＞0.05); COL2a1的基因表達(dá)顯示兩組3d時表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，且含藥組更加顯著(P＜0.01)，7d后均明顯下降(P＜0.05)，但含藥組仍比壓力組表達(dá)水平高(P＜0.05)，14d兩組表達(dá)水平均較低無明顯差異(P＞0.05)

15、。
　　結(jié)論：
　　青娥方能有效改善腎虛血瘀型椎間盤源性腰痛患者的臨床癥狀與功能活動，隨訪期療效穩(wěn)定;
　　離體兔脊柱運(yùn)動節(jié)段可在短周期內(nèi)(14d)作為研究生物力學(xué)對椎間盤影響的離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?
　　建立了一個針對離體兔脊柱運(yùn)動節(jié)段的壓力退變模型，該模型可作為研究生物力學(xué)與椎間盤退變的相關(guān)性，以及中藥防治椎間盤退變機(jī)制的離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?
　　青娥方含藥血清短期內(nèi)(7d)能一定程度上延緩椎間盤退變，為補(bǔ)腎活血法對