SCF信號對肥大細(xì)胞IL-13的產(chǎn)生及遷移性的影響.pdf

1、研究背景：
　　肥大細(xì)胞起源于骨髓造血干細(xì)胞，其前體細(xì)胞在組織中進(jìn)一步發(fā)育成熟[1]。肥大細(xì)胞一方面可作為效應(yīng)細(xì)胞在變態(tài)反應(yīng)中起作用，另一方面也可通過表達(dá)協(xié)同刺激分子和分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)體內(nèi)多種生物學(xué)過程。肥大細(xì)胞表面FcεRⅠ的交聯(lián)反應(yīng)引發(fā)組胺等炎癥介質(zhì)的釋放，從而介導(dǎo)過敏反應(yīng)的早期相。更為重要的是，激活的肥大細(xì)胞可通過合成和釋放嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-8等趨化因子，募集嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等到達(dá)組織局部，參與過敏反應(yīng)的

2、晚期相反應(yīng)。
　　干細(xì)胞因子（Stem Cell Factors，SCF）也稱為肥大細(xì)胞生長因子。它來源于成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。SCF是體內(nèi)重要的生長因子，可以促進(jìn)造血前體細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和生殖細(xì)胞等多種細(xì)胞的增生、遷移、存活和分化。SCF信號對于肥大細(xì)胞的生長、存活、粘附、激活等生物學(xué)活性也具有重要作用。但有研究表明哮喘患者血清和痰液中SCF含量升高，但SCF與哮喘發(fā)病之間的關(guān)系不清[2-

3、3]。
　　支氣管哮喘（簡稱哮喘）是常見的慢性呼吸道疾病之一，其發(fā)病率近年呈上升趨勢[4]。哮喘是一種多種細(xì)胞（包括嗜酸性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等）參與的慢性氣道炎癥，以氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為主要特征。有證據(jù)顯示哮喘癥狀的嚴(yán)重性與氣道中肥大細(xì)胞積聚的數(shù)量及其活化的程度相關(guān)。哮喘的發(fā)病與Th2型細(xì)胞因子IL-13有密切聯(lián)系已為我們所熟知[5]。IL-13主要由活化的T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生。其可通

4、過促進(jìn)成肌纖維細(xì)胞的生成、膠原的沉積[6]以及氣道上皮細(xì)胞的化生[7]而介導(dǎo)氣道高反應(yīng)性和氣道重塑[8]的形成。最近的研究表明SCF與過敏原介導(dǎo)的氣道重塑[9]相關(guān)，但詳細(xì)的機制不清。由于肥大細(xì)胞在哮喘的發(fā)生和發(fā)展中均起到重要作用，因此為了說明SCF與哮喘發(fā)病之間的關(guān)系，有必要探討SCF信號對肥大細(xì)胞IL-13的產(chǎn)生及遷移性的影響。
　　目的：研究SCF信號對肥大細(xì)胞P815 IL-13的產(chǎn)生及遷移性的影響。
　　方法：

5、r>　　1.采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）和Western blot檢測肥大細(xì)胞P815 c-Kit受體的表達(dá)。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測不同濃度（1-100ng/ml）SCF刺激P815細(xì)胞不同時間（6h，12h，24h,48h，72h）后，IL-13的產(chǎn)生情況。
　　3.分別使用MEK/ERK通路抑制劑U0126（10μM）、JAK/STAT3通路抑制劑JSI-124（100nM）、PI3K/Akt通路抑制劑

6、Wortmannin（1μM）、CREB阻斷劑H-89（20μM）、NF-κB阻斷劑PDTC（50μM）預(yù)處理P815細(xì)胞30min后，再用SCF（50ng/ml）刺激6h，ELISA檢測P815細(xì)胞 IL-13產(chǎn)生的情況。
　　4. Western blot檢測肥大細(xì)胞P815在SCF（50ng/ml）刺激不同時間（0min，15min，30min，60min）后，信號通路蛋白Erk磷酸化情況。
　　5.電泳遷移率滯后試驗

7、（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）檢測肥大細(xì)胞P815在SCF（50ng/ml）刺激1h后，核轉(zhuǎn)錄因子CREB的活化情況。
　　6.收集SCF（50ng/ml）刺激6h后P815細(xì)胞，進(jìn)行熒光定量PCR，檢測可以結(jié)合到IL-133’-UTR區(qū)miRNAs（miR-200c、miR-194、miR-34b-5p、miR-449b、miR-200b、miR-362-3p、miR-98

8、、miR-410、miR-429、miR-34a、miR-34c及miR-449c）的表達(dá)情況。
　　7. Transwell細(xì)胞遷移實驗，觀察肥大細(xì)胞P815在SCF（10ng/ml）單獨刺激或者先用Anti-CCL2（1ng/ml）抗體或者先用CCL2同型對照抗體（1ng/ml）預(yù)處理2h，再用SCF（10ng/ml）刺激后遷移細(xì)胞數(shù)的情況。
　　結(jié)果：
　　1.肥大細(xì)胞P815中存在c-Kit的表達(dá)，幾乎所有肥大

9、細(xì)胞P815細(xì)胞膜表面存在c-Kit受體的表達(dá)。
　　2.不同濃度的SCF（1-100ng/ml）刺激P815細(xì)胞6h均可促進(jìn)其產(chǎn)生IL-13（p<0.01），以10-50ng/ml效果最為明顯。50ng/ml的SCF作用于P815細(xì)胞不同時間（6h，12h，24h,48h，72h），IL-13產(chǎn)生明顯升高（p<0.01）。另外，SCF（50ng/ml）刺激P815細(xì)胞6h，IL-6分泌也增加（p<0.05），而IFN-γ和IL-

10、10分泌降低（p<0.05）。
　　3.與SCF單刺激組相比，JSI-124+SCF組、Wortmannin+SCF組和PDTC+SCF組IL-13的產(chǎn)生無明顯差異，而U0126+SCF組和H-89+SCF組IL-13的產(chǎn)生明顯降低（p<0.01）；
　　4. P815細(xì)胞未刺激組磷酸化Erk1/2條帶較弱，而SCF（50ng/ml）刺激15min后磷酸化Erk1/2條帶亮度有所增加，30min達(dá)到高峰，60min呈現(xiàn)降低趨

11、勢。
　　5.未刺激組CREB滯后帶較弱，而SCF（50ng/ml）刺激P815細(xì)胞1h后出現(xiàn)明顯的CREB滯后帶。
　　6. SCF（50ng/ml）刺激肥大細(xì)胞P8156h后，miR-200c、miR-34b-5p及miR-449b的表達(dá)升高，miR-200b、miR-362-3p、miR-98、miR-410、miR-429、miR-34a、miR-34c、miR-449c及miR-362-3p的表達(dá)降低，其中以miR

12、-449c的降低最為明顯。
　　7.與未刺激組相比，SCF（10ng/ml）刺激P815細(xì)胞不同時間（3h，6h，12h，24h）后遷移細(xì)胞數(shù)均明顯增多（p<0.01）。與SCF（10ng/ml）單刺激組相比， Anti-CCL2+SCF(10ng/ml)組P815遷移細(xì)胞數(shù)明顯降低（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.幾乎所有肥大細(xì)胞P815細(xì)胞膜表面存在c-Kit受體的表達(dá)。
　　2.SCF通過啟動MEK-