慢性腎衰竭情況下膽汁酸代謝的臨床及實驗研究.pdf

1、背景與目的:
　　膽汁酸是肝臟合成的對食物中脂肪及脂溶性維生素的乳化、消化、吸收起重要作用的物質。除了小部分的膽汁酸隨糞便排出體外從而丟失，大部分進入腸道的膽汁酸會在回腸被主動吸收進入門脈系統(tǒng)。門靜脈內(nèi)的膽汁酸會被肝臟重新攝取，完成腸肝循環(huán)。肝臟合成的膽汁酸主要用來補充糞便途徑丟失，膽汁酸腸肝循環(huán)在轉錄水平對膽汁酸從頭合成途徑起重要調節(jié)作用。通常認為，除了膽汁淤積等一些特殊情況下，腎臟對膽汁酸的濾過、重吸收及分泌作用對膽汁酸的代謝

2、及平衡幾乎沒有影響。在健康人群中，膽汁酸通過腎臟途徑的代謝量可以忽略不計。
　　腎臟主要作用是排出代謝產(chǎn)物、維持體內(nèi)水及電解質平衡、調節(jié)血脂代謝、調節(jié)血壓、分泌及降解激素、產(chǎn)生和利用體循環(huán)中葡萄糖，因此腎臟在維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起到重要作用。隨著慢性腎臟病進行性、慢性進展，腎單位逐漸減少，腎功能不可逆下降，繼而出現(xiàn)代謝產(chǎn)物和毒物滯留，水電解質和酸堿平衡紊亂以及內(nèi)分泌失調，最終導致慢性腎衰竭。然而近年來的研究表明，當腎臟功能受到損害

3、時，不僅會出現(xiàn)以上所述高血壓、碳水化合物及脂肪代謝紊亂等常見的表現(xiàn)，還會導致血漿膽汁酸水平增高及膽汁酸代謝紊亂。
　　為了找到腎衰竭環(huán)境下血漿膽汁酸水平增高及膽汁酸代謝紊亂的原因，人們已經(jīng)進行了許多動物實驗研究?，F(xiàn)有的研究結果表明，腎衰竭動物模型中的肝臟膽汁酸合成限速酶一膽固醇7α-羥化酶活性與正常對照組無明顯變化，進一步實驗證明在腎衰竭動物模型中，肝臟膽汁酸合成速度無明顯變化。
　　然而以上研究只是證明在腎哀竭動物模型中膽

4、汁酸從頭合成途徑未受到影響，沒有測定膽汁酸轉運蛋白的表達，也缺乏臨床相關研究資料，因此沒有找到血漿膽汁酸水平增高及膽汁酸代謝紊亂的真正原因。本研究的目的就是找出腎衰竭環(huán)境下可能影響膽汁酸代謝的因素。另外本研究是首次從動物模型及臨床兩個方面對腎衰竭條件下膽汁酸代謝情況進行系統(tǒng)研究。
　　材料和方法:
　　1.動物模型
　　適應性喂養(yǎng)一周后采用完全隨機化方法進行分組。首先將動物按照體重大小編號，從隨機數(shù)字表中任一行開始抄取

5、48個隨機數(shù)字，如遇相同數(shù)字，抄取下一個隨機數(shù)字。對隨機數(shù)字按照從小到大排序，排序后規(guī)定前16個為腎衰竭組，后16個為假手術組，中間16個為單側腎切除組。
　　采用文獻中介紹的手術方法制作腎衰竭、單側腎切除及假手術組模型。腎衰竭組實施5/6腎切除，首先切除2/3左側腎組織，1周后切除整個右腎。單側腎切除組第一次手術時僅分離腎臟包膜，假手術組大鼠兩次手術都僅分離腎臟包膜。所有大鼠術后應用青霉素預防感染。
　　所用動物在禁食過夜

6、條件下采眼底靜脈血4次，分別為手術開始前1天，手術實施后2周、4周、6周，實驗8周處死動物時心臟穿刺取血。得到血漿后-80℃凍存。實驗8周時處死動物，無菌手術打開腹腔，摘除肝臟、腎臟、回腸備用。分別于手術開始前及大鼠處死前24小時將大鼠置入代謝籠中，收集24小時尿液，-80℃冰箱凍存。
　　2.動物生化指標檢測
　　血漿總膽固醇及肌酐水平采用自動生化儀測量。血漿總膽汁酸采用生化試劑盒測量。結合膽汁酸及游離膽汁酸測定采用高效液

7、相色譜一串聯(lián)質譜法。尿蛋白濃度測定采用生化試劑盒測量。
　　3.分離培養(yǎng)近端腎小管上皮細胞及FXR信號通路檢測
　　將從腎組織中得到的近端腎小管上皮細胞在DMEM細胞培養(yǎng)液中做原代培養(yǎng)，向培養(yǎng)成功的細胞中加入FXR基因激動劑，通過RT-PCR及蛋白質免疫印跡方法檢測FXR信號通路完整性。
　　4.RT-PCR及蛋白質免疫印跡方法檢測組織中各種膽汁酸代謝相關蛋白及相關基因表達情況
　　檢測項目有:大鼠肝臟膽汁酸合成

8、限速酶Cy8b1及Cyp7a1mRNA水平;大鼠肝臟Cyp7a1蛋白表達;大鼠肝臟Bsep， Ntcp，Slcoa1，Mrp3，Mrp4，Ost-α，F(xiàn)xr以及Shp mRNA水平;大鼠肝臟Bsep，Ntcp，Slcoa1， Mrp2， Mrp3以及Ost-α蛋白質表達;大鼠腎臟ASBT，Slcoa1，Mrp3，Mrp4，Ost-α，Ost-β，F(xiàn)xr以及Shp mRNA水平;大鼠腎臟Asbt，Mrp3以及Ost-α蛋白質表達;大鼠回腸

9、ASBT，Mrp3，Ost-α，Ost-β mRNA水平;大鼠回腸ASBT，Mrp3，Ost-α蛋白質表達;人類腎臟ASBT，Mrp2，Ost-α，Ost-β mRNA水平;人類腎臟ASBT，Mrp2，Ost-α蛋白質表達。
　　5.臨床資料的收集
　　共收集了兩組病例資料。一組均為腎衰竭患者，61例，將34例患有良惡性腫瘤，需要接受單側腎切除患者納入對照組。所有對照組患者在手術前完成了血液及尿液樣本收集。腎衰竭組的腎臟組織

10、標本來源于腎臟穿刺活檢，對照組標本來源于切除腎臟組織，選取遠離腫瘤部位腎皮質取材。
　　6.血液標本及尿液標本生化指標測定
　　采用日立7600全自動生化儀測量谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、血糖、膽固醇、甘油三酯等生化指標。第五代循環(huán)酶速率法測定血液及尿液標本中總膽汁酸濃度。
　　7.腎臟組織病理檢查
　　病理標本進行常規(guī)切片，分別常規(guī)進行HE、MASSON染色。
　　結果:
　　1.大鼠生化指標改變

11、
　　與假手術組相比，慢性腎衰竭大鼠血漿肌酐濃度明顯升高，計算腎小球率過濾明顯降低，表明模型建造成功。除此之外，與假手術組相比，腎衰竭組表現(xiàn)出輕度的蛋白尿，膽固醇濃度明顯升高。與此同時，腎衰竭動物組血漿總膽汁酸水平明顯升高。在高效液相色譜—串聯(lián)質譜法中的到的數(shù)據(jù)可以看出，每一種膽汁酸幾乎都有兩倍以上的升高，比如CA，CDCA，MCA，HDCA，尤其是非結合膽汁酸更為明顯。而6-羥基膽汁酸，比如MCA和HDCA的比率和假手術組無明顯

12、差異。
　　2.腎衰竭對肝臟膽汁酸生成限速酶的影響
　　兩組中7α-羥化酶的表達在mRNA及蛋白質水平上都無明顯差異。而且在對一種膽酸合成酶Cyp8b1的mRNA表達檢測中發(fā)現(xiàn)腎衰竭組和假手術組基本無差別。
　　3.腎衰竭對肝臟、回腸、腎臟中膽汁酸轉運蛋白表達情況的影響
　　腎衰竭組大鼠肝臟基底側膽汁酸攝取轉運蛋白在mRNA及蛋白質水平均無明顯差異，然而基底側膽汁酸輸出蛋白Mrp3，Ost-α，Ost-β的mRN

13、A水平明顯增高，蛋白免疫印跡實驗進一步證明Mrp3，Ost-α在蛋白質水平上表達升高。在肝臟的毛細膽管側，膽汁酸輸出蛋白的表達與假手術組無明顯差異。
　　由于Mrp3，Ost-α以及Ost-β都是Fxr基因的靶向基因，而Fxr基因可以被膽汁酸激活，因此我們又對腎衰竭組、假手術組中的Fxr基因以及其下游的Shp基因進行了對比。通過對比發(fā)現(xiàn)兩組中Fxr基因、Shp基因的mRNA水平無明顯差異。Shp基因的表達與7α-羥化酶基因表達情況

14、一致，表明血漿中高膽汁酸水平并沒有對肝臟膽汁酸的從頭合成途徑進行負反饋調節(jié)。
　　在肝臟中出現(xiàn)的膽汁酸轉運蛋白表達改變并沒有出現(xiàn)在回腸及殘余的116腎臟組織中。Fxr基因以及Shp基因的表達情況也在回腸、腎臟組織中進行了檢測，同樣，腎衰竭組與假手術組間無明顯差別，表明Fxr信號途徑在腎衰竭組中并沒有被激活。
　　4.FXR基因激動劑對腎衰竭大鼠近端腎小管上皮細胞中FXR的靶向基因的影響
　　將含有以上實驗得到的大鼠近端

15、腎小管上皮細胞中加入FXR基因激動劑后FXR基因的靶向基因Shp和Mrp2的mRNA水平明顯升高，與此同時，F(xiàn)XR基因表達水平無明顯變化。膽汁酸轉運蛋白Ost-α和Ost-β的mRNA表達水平明顯升高，Slco1a1的mRNA表達水平降低。FXR基因信號通路在腎衰竭情況下仍然保持完整有效，刺激FXR基因信號通路會對近端腎小管上皮細胞中膽汁酸轉運蛋白的表達產(chǎn)生影響。
　　5.單側腎切除對肝腎及腎臟膽汁酸轉運蛋白的影響
　　單側

16、腎切除大鼠血漿總膽汁酸水平也會升高，與此同時，肝臟膽汁酸合成限速酶7α-羥化酶的表達無明顯改變。肝臟基底側膽汁酸轉運蛋白Ost-α和Ost-β的mRNA表達水平升高，而殘留腎臟中膽汁酸轉運蛋白較對照組無明顯差異。
　　6.腎衰竭組及對照組患者血漿生化指標及尿膽汁酸水平統(tǒng)計結果
　　在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，血漿總膽汁酸、肌酐、甘油三酯水平較對照組升高，差別有統(tǒng)計學意義，這種生化指標的改變符合腎衰竭患者的一般規(guī)律。谷丙轉氨酶、谷草轉

17、氨酶、膽固醇在、血糖水平在兩組中的差別無統(tǒng)計學意義。腎衰竭組尿中總膽汁酸濃度與對照組間無明顯差別，然而腎衰竭組24h尿量較對照組明顯減少，因此24h尿膽汁酸總量明顯減少，差別有統(tǒng)計學意義。
　　7.腎臟組織病理學檢查結果
　　在腎衰竭組，我們看到腎小球系膜細胞、血管內(nèi)皮細胞增生，腎小球硬化、腎間質纖維化、腎血管硬化等病理改變。
　　8.腎小球濾過率及其與血漿總膽汁酸水平的關系
　　兩組中估算的腎小球濾過率有明顯差

18、異:在腎衰竭組中，通過公式計算出的腎小球濾過率平均值為27.56ml/min/1.73m2，對照組計算出的腎小球濾過率平均值為100.44ml/min/1.73m2。皮爾森相關分析計算出血漿總膽汁酸水平與腎小球率過濾之間是相關的。而在對照組中，血漿總膽汁酸水平與腎小球率過濾之間無相關關系。
　　9.腎衰竭患者腎臟組織中膽汁酸轉運蛋白表達情況
　　腎衰竭組膽汁酸轉運蛋白與對照組在轉錄水平無明顯差異，在蛋白質水平上也無明顯差異。

19、
　　結論:
　　1.動物實驗表明腎衰竭以及單側腎切除都能夠導致血漿總膽汁酸水平升高，因此血漿總膽汁酸水平升高在腎臟功能受到損害的初期就能表現(xiàn)出來。本次腎衰竭模型試驗中觀察到，膽汁酸從頭合成途徑未受到影響，肝臟細胞基底側Mrp3，Ost-α，Ost-β基因表達增強。這可能是對腎衰竭環(huán)境產(chǎn)生的反應，通過提高血漿總膽汁酸水平向其他組織中傳導信號;或者是肝臟對腎衰竭環(huán)境的一種自我保護機制，使膽汁酸更容易從肝臟細胞基底膜側排出肝臟。