HMGB1 siRNA在體內(nèi)體外減輕高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜細(xì)胞損害的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是成年人獲得性致盲的主要原因。糖尿病視網(wǎng)膜病變的特征包括視神經(jīng)受損、毛細(xì)血管基底膜增厚、視網(wǎng)膜周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的丟失、微動脈瘤的形成、視網(wǎng)膜新生血管生成和玻璃體出血。DR視力損害的原因是復(fù)雜的，目前尚未完全闡明。大量證據(jù)表明，慢性低度炎癥的持續(xù)存在是DR重要的發(fā)病機(jī)制之一。
　　HMGB1又稱為高遷移率蛋白1，做為一種公認(rèn)的促炎癥因子，HMGB1在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用已經(jīng)引起了研

2、究人員的關(guān)注。然而，HMGB1 siRNA能否在高糖環(huán)境下保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞的形態(tài)變化和功能異常尚鮮有研究。本研究旨在探討HMGB1 siRNA在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的保護(hù)作用。
　　研究方法:第一部分:通過鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病視網(wǎng)膜病變的大鼠模型和用高濃度葡萄糖處理視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞建立體外細(xì)胞模型，檢測HMGB1在體內(nèi)外高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜細(xì)胞中的表達(dá)。第二部分實(shí)驗(yàn)分體內(nèi)和體外兩部分。體內(nèi)部分:80只SD大鼠隨機(jī)分為4組:正常對

3、照組(NC組)、糖尿病組（DM組）、非特異性siRNA組（scr-siRNA組），HMGB1 siRNA組(siRNA組)。糖尿病成模后16周，siRNA組大鼠予以球內(nèi)注射HMGB1 siRNA2μl，scr-siRNA組注射同等量的非特異性siRNA，NC組和DM組注射等量的無菌生理鹽水。注射后一周進(jìn)行各組大鼠視網(wǎng)膜的HMGB1的免疫組化定位和westernblot定量檢測，TUNEL法檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況，通過熒光血管造影和視網(wǎng)膜

4、電圖檢測大鼠視網(wǎng)膜血管和功能情況。體外部分:對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA，之后檢測細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、ROS產(chǎn)物情況，同時(shí)檢測凋亡相關(guān)蛋白及HMGB1相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:糖尿病的大鼠模型建立后，結(jié)果顯示糖尿病組大鼠從第4周開始出現(xiàn)視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞密度降低，可見微血管病變，血管擴(kuò)張，隨著病程的延長，出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的水腫、變少、視網(wǎng)膜細(xì)胞排列紊亂和內(nèi)、外核層的變薄，可見突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的

5、血管內(nèi)皮細(xì)胞。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)隨著病程的延長，凋亡陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，與對照組相比，糖尿病4周、8周和16周的凋亡指數(shù)具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.873、5.794、12.037，P＜0.05)。免疫組織化學(xué)染色顯示實(shí)驗(yàn)初期HMGB1主要表達(dá)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核中，隨著病變的進(jìn)展HMGB1的表達(dá)增多，從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層擴(kuò)展到內(nèi)、外核層，且分布有從細(xì)胞核向細(xì)胞漿中轉(zhuǎn)移的趨勢。western blot定量實(shí)驗(yàn)也證實(shí)HMGB1的蛋白表達(dá)

6、呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性增多的特點(diǎn)(t=3.252、39.504、14.773，P＜0.05)，HMGB1 mRNA的表達(dá)也呈現(xiàn)出同樣的趨勢(t=6.907、23.794、6.20，P＜0.05)。體外部分，在細(xì)胞層面，CCK8結(jié)果顯示高濃度葡萄糖可以抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力，48小時(shí)和72小時(shí)的細(xì)胞活力與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=5.098、6.095，P＜0.05)，同時(shí)HMGB1的蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增高(t=15.096、3

7、4.580、7.054，P＜0.05)。
　　經(jīng)免疫組織化學(xué)染色和western blot檢測發(fā)現(xiàn):與球內(nèi)注射非特異性siRNA組相比，球內(nèi)注射HMGB1 siRNA后可以明顯減少HMGB1蛋白的表達(dá)(t=24.365，P＜0.05)，適用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。TUNEL檢測顯示糖尿病組和非特異性siRNA組的凋亡指數(shù)明顯高于正常對照組(t=3.508、7.665，P＜0.05)，HMGB1 siRNA組的凋亡指數(shù)較非特異性siRNA

8、組降低(t=3.965，P＜0.05)。熒光血管造影顯示:高糖組和非特異性siRNA組大鼠視網(wǎng)膜周邊毛細(xì)血管迂曲，可見血管閉塞及無灌注區(qū)，造影晚期可見熒光滲漏，HMGB1 siRNA組的視網(wǎng)膜血管閉塞情況得到改善，滲漏情況較非特異性siRNA組明顯好轉(zhuǎn)。電生理檢測顯示:HMGB1siRNA組的a波、b波的振幅均高于非特異性siRNA組(t=6.132、5.733，P＜0.05)，而非特異性siRNA組和高糖組的a波、b波振幅沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

9、異(t=2.443、13.370，P＞0.05)。
　　體外模型部分，我們先通過western blot檢測以探明siRNA對HMGB1的沉默作用效率，結(jié)果顯示HMGB1 siRNA組HMGB1蛋白表達(dá)水平與非特異性siRNA組相比降低了75％(t=3.348，P＜0.05)，而正常對照組和非特異性siRNA組之間無顯著性差異（t=23.578，P＞0.05），此模型適用于進(jìn)一步研究。正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，形態(tài)為梭形，

10、高濃度葡萄糖處理后細(xì)胞部分漂浮，體積變小，少量細(xì)胞變?yōu)閳A形，HMGB1 siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞形態(tài)接近正常。經(jīng)Hochest33342染色后，正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失。凋亡細(xì)胞核被染成亮藍(lán)色，部分染色質(zhì)濃縮，呈碎塊狀或半月形致密染色。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，HMGB1 siRNA組細(xì)胞凋亡率與非特異性siRNA組相比顯著下降（23.6±2.4％與47.6±1.98％，t=2.674，p＜0.05）。CCK

11、8檢測顯示:HMGB1 siRNA預(yù)處理可以提高HRECs的細(xì)胞活力。ROS檢測顯示:與正常對照組相比，高糖組和非特異性siRNA組ROS產(chǎn)量增加約50％，而兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=43.650，p＞0.05)。HMGB1 siRNA轉(zhuǎn)染可以抑制ROS產(chǎn)生盼增加趨勢(t=29.037，p＜0.05)。western blot檢測發(fā)現(xiàn)HMGB1 siRNA預(yù)處理可以抑制cleaved-caspase3表達(dá)，提高Bcl2的表達(dá)。wes