番茄紅素對永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬結(jié)構(gòu)NIX參與的線粒體自噬的影響.pdf

1、血管性癡呆（Vascular dementia，VD）是指由于長期處于各種缺血性、出血性及腦缺血缺氧性損害等腦血管病危險因素下，最終導(dǎo)致的獲得性智能障礙綜合征，為老年期癡呆的常見類型之一。氧化應(yīng)激是體內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生與清除失去平衡而導(dǎo)致的一系列氧化性損傷過程，現(xiàn)普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激是VD發(fā)生發(fā)展的主要危險因素之一。永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈（2-vessel occlusion，2VO）的

2、大鼠通過阻斷雙側(cè)頸總動脈血流使其腦組織處于低灌注低氧狀態(tài)，尤其容易使得海馬、皮層等與認(rèn)知功能有關(guān)的結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化應(yīng)激，最終發(fā)生學(xué)習(xí)記憶能力的損害。線粒體作為體內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源，亦是ROS攻擊的重要靶點，后者使得線粒體發(fā)生功能障礙，線粒體膜電位（Mitochondrial transmembrane potential，Δψm）降低，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(Mitochondrial permeability transition p

3、ore,MPTP)開放，引發(fā)細(xì)胞凋亡或自噬等改變。番茄紅素（Lycopene）是類胡蘿卜素家族中的一員，具有強(qiáng)有力的淬滅單個氧原子及清除過氧化自由基的能力。因此，清除受損的線粒體，降低細(xì)胞ROS水平，拮抗氧化應(yīng)激很可能是干預(yù)治療血管性癡呆的一種行之有效的手段。
　　線粒體自噬（Mitophagy）是線粒體在低氧、饑餓等應(yīng)激狀態(tài)下，損傷的線粒體選擇性的被自噬泡所吞噬降解的過程。在低氧環(huán)境中，適當(dāng)?shù)木€粒體自噬可通過及時清除受損線粒體而

4、對細(xì)胞起到保護(hù)作用，然而過度的線粒體自噬則可引發(fā)自噬性死亡等負(fù)性改變。NIX蛋白（Nip3-like protein X,NIX）主要位于線粒體外膜，當(dāng)線粒體受到損害時，NIX表達(dá)上調(diào)，可與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain3，LC3）相結(jié)合，引起自噬體吞噬損傷線粒體并與溶酶體相融合，以此清除受損線粒體。LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型，LC3-Ⅱ的表達(dá)或 LC3-Ⅱ/LC3

5、-Ⅰ的比值可反映細(xì)胞的自噬水平。低氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia-inducible factor1α，HIF-1α）是細(xì)胞針對低氧應(yīng)答產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)機(jī)體處于低氧狀態(tài)，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，ROS產(chǎn)生增多，最終可激活HIF-1α，后者又可激活NIX基因，NIX表達(dá)上調(diào)，引起NIX參與的自噬的產(chǎn)生，故HIF-1α既是2VO大鼠腦內(nèi)低氧環(huán)境所誘導(dǎo)產(chǎn)生的，又是NIX表達(dá)上調(diào)的前提條件。
　　目的：
　　觀察番茄紅素早期干預(yù)對2VO

6、大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬結(jié)構(gòu)的影響；觀察2VO大鼠及早期干預(yù)后海馬結(jié)構(gòu)NIX參與的線粒體自噬水平，從而探討NIX參與的線粒體自噬在2VO大鼠海馬結(jié)構(gòu)中的可能作用。
　　方法：
　　(1)大鼠隨機(jī)分組后，各劑量組大鼠術(shù)后7天立即給予不同劑量的番茄紅素水溶液，假手術(shù)組及模型組大鼠給予雙蒸水，隔天灌胃給藥一次，持續(xù)1月。
　　(2)以Morris水迷宮檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，HE染色觀察比較各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)各區(qū)域組織形態(tài)學(xué)改

7、變。
　　(3)腦片熒光染色法、共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)觀測各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)ROS改變。
　　(4)Tunel法、共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)檢測各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡率。
　　(5)Western blot檢測海馬結(jié)構(gòu)LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值。
　　(6)熒光免疫組化法、共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)觀察各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)NIX、LC3B、HIF-1α的熒光強(qiáng)度，運(yùn)用體視學(xué)計算NIX-LC3B-MitoTracker

8、 Green共定位數(shù)和HIF-1α-DAPI共定位數(shù)。
　　結(jié)果：
　?。?）各組大鼠在術(shù)前平均逃避潛伏期及術(shù)后運(yùn)動速度沒有明顯差別的基礎(chǔ)上，模型組大鼠的平均逃避潛伏期較假手術(shù)組大鼠增高（P<0.05），模型組大鼠的趨向式和直線式的總比例較假手術(shù)組大鼠減少（P<0.05），低劑量組大鼠平均逃避潛伏期較模型組大鼠明顯縮短（P<0.05），模型組與低劑量組大鼠趨向式和直線式的總比例有明顯差別（P<0.05），且三個藥物劑量組中，

9、以低劑量組大鼠逃避潛伏期最短，趨向式和直線式的總比例最高（P<0.05）。
　?。?）假手術(shù)組大鼠海馬結(jié)構(gòu)錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞層次分明，排列緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核大而清晰，呈圓形。模型組大鼠細(xì)胞層次不清，排列紊亂，胞體收縮，胞質(zhì)深染，呈不規(guī)則形，細(xì)胞周圍間隙增大，呈空泡樣變，細(xì)胞核深染不可見。低劑量組大鼠海馬結(jié)構(gòu)錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞改變類似假手術(shù)組，中、高劑量組大鼠海馬結(jié)構(gòu)錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞都存在一定程度的病理改變。
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10、3）各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3、DG區(qū)及三區(qū)總量的ROS熒光強(qiáng)度存在組間差異（P<0.01），其中模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu) CA1、CA3、DG及三區(qū)總量 ROS熒光強(qiáng)度較假手術(shù)組和低劑量組顯著增加（P<0.01），三個藥物劑量組中，以低劑量組大鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3、DG三區(qū)的總量 ROS熒光強(qiáng)度顯著低于中劑量組（P<0.01）和高劑量組（P<0.01）。
　?。?）各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)CA3及CA1、CA3、DG三區(qū)的總量細(xì)胞凋亡

11、率存在組間差異（P<0.05），CA1、DG區(qū)細(xì)胞凋亡率組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。觀察統(tǒng)計學(xué)有意義的區(qū)域細(xì)胞凋亡率的趨勢，假手術(shù)組大鼠海馬結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡率低于模型組，三個藥物劑量組中，以低劑量組細(xì)胞凋亡率最低，且低劑量組細(xì)胞凋亡率亦低于假手術(shù)組。
　?。?）LC3BⅡHMP/LC3BⅠ(HMP+HCP)在各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)細(xì)胞中存在組間差異（P<0.05），LC3BⅡHTP/LC3BⅠHTP在各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)細(xì)胞中組間沒

12、有差別（P>0.05）。觀察其趨勢，模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu)細(xì)胞線粒體上的LC3BⅡ的表達(dá)較假手術(shù)組高，三個藥物劑量中以中劑量組LC3BⅡ的表達(dá)最高，其次是低劑量組和高劑量組。
　?。?）各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3和DG區(qū)及三區(qū)總量NIX平均熒光強(qiáng)度值組間差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3、DG區(qū)及三區(qū)的總量NIX的表達(dá)均高于假手術(shù)組（P<0.01）和低劑量組（P<0.01）。LC3B平均熒光強(qiáng)

13、度值DG區(qū)組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），CA1、CA3區(qū)及三區(qū)總量組間差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。其中，模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu) CA1區(qū)LC3B的表達(dá)高于假手術(shù)組（P<0.01）和低劑量組（P<0.01）。各組大鼠CA1、CA3、DG區(qū)及三區(qū)總量NIX-C3B-Mito Tracker Green共定位數(shù)目均存在組間差異(P<0.01）。其中，模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu)CA3區(qū)共定位數(shù)目較假手術(shù)組多（P<0.05），CA1及C

14、A3區(qū)共定位數(shù)目較低劑量組多（P<0.05）。
　?。?）各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3區(qū)及三區(qū)總量HIF-1α的表達(dá)均存在組間差異（P<0.05），DG區(qū)HIF-1α的表達(dá)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。其中，模型組海馬結(jié)構(gòu)HIF-1α的表達(dá)較假手術(shù)組高，三個藥物劑量組中，中、高劑量組海馬結(jié)構(gòu)HIF-1α的表達(dá)均較低劑量組高。各組大鼠 CA1、CA3、DG區(qū)及三區(qū)總量HIF-1α-DAPI共定位數(shù)目均存在組間差異（P<0.

15、05）。其中，模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、DG區(qū)共定位數(shù)目較假手術(shù)組高（P<0.05），三個藥物劑量組中，以低劑量組大鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、DG區(qū)及三區(qū)總量共定位數(shù)目最低（P<0.05）。
　?。?）NIX-LC3B-MitoTracker Green與HIF-1α-DAPI共定位數(shù)目在大鼠海馬結(jié)構(gòu)各個區(qū)域及三區(qū)總量中都呈正相關(guān)性（CA1：r2=0.773，P<0.01；CA3：r2=0.497，P<0.05；DG r2=0.511，P

16、<0.05；三區(qū)總量：r2=0.698，P<0.05）。NIX熒光強(qiáng)度與HIF-1α-DAPI共定位數(shù)目在大鼠海馬結(jié)構(gòu)各個區(qū)域及三區(qū)總量中都呈正相關(guān)性（CA1：r2=0.673，P<0.01；CA3：r2=0.570，P<0.01；DG：r2=0.431，P<0.05；三區(qū)總量：r2=0.803，P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　4.12VO大鼠為VD可靠模型。
　　4.22VO大鼠海馬結(jié)構(gòu)存在低氧狀態(tài)，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，