Orexin參與REM期睡眠剝奪后大鼠海馬自噬機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述。
　　第一部分 REM期睡眠剝奪對大鼠海馬組織自噬水平的影響
　　目的:探究REM期睡眠剝奪后大鼠海馬組織中是否有自噬活動參與及其水平的改變。
　　方法:選取SD大鼠為研究對象，將實驗動物分為REM睡眠剝奪組、水環(huán)境對照組、正?？瞻讓φ战M，采用改良多平臺睡眠剝奪法來建立本實驗所需的睡眠剝奪模型，首先選擇免疫熒光觀察到三組大鼠海馬區(qū)自噬體的形成;隨后利用western blot檢測大腦海馬

2、組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:REM期睡眠剝奪后，在免疫熒光下可觀察到三組大鼠的海馬組織均有自噬體存在;對自噬過程中特征性蛋白LC3B及P62進(jìn)行WB定量檢測后可見:與兩個對照對相比，實驗組的大鼠海馬組織勻漿中LC3B表達(dá)明顯升高(p＜0.05)，P62蛋白表達(dá)量下降(p＜0.05)。同時兩個對照組間LC3B及P62蛋白的表達(dá)量相差不大(p＜0.05)。
　　結(jié)論:REM期睡眠剝奪后大鼠海馬組織的自噬活動被激活

3、。
　　第二部分 orexin對海馬神經(jīng)元誘導(dǎo)時間、濃度的篩選及對應(yīng)自噬蛋白的表達(dá)
　　目的:觀察orexin對體外海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性及自噬水平的影響。
　　方法:本實驗選擇大鼠原代海馬細(xì)胞為研究對象，給予不同濃度梯度(0mol/L、10-11mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L)的orexin干預(yù)2小時和時間梯度(0h、2h、4h、6h、8h)10-7mol/LOrexin進(jìn)行刺激，利用CCK8試劑盒檢

4、測不同干預(yù)條件下的細(xì)胞活性的變化;另外，針對自噬的改變，首先利用細(xì)胞免疫熒光下觀察是否有自噬小體存在，隨后利用WB對不同時間和不同濃度的orexin干預(yù)后自噬蛋白P62進(jìn)行定量檢測選取最合適的實驗條件。
　　結(jié)果:在刺激2小時的條件下，隨著orexin濃度的不斷增加海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性率也逐漸上升，選擇濃度10-7mol/L組與其空白組相比，結(jié)果有差異(P＜0.05);而固定orexin的刺激濃度10-7mol/L后，隨著干預(yù)時間的

5、延長，海馬神經(jīng)元細(xì)胞的活性也呈增高趨勢，在4小時節(jié)點檢測的細(xì)胞活性較空白對照組有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。細(xì)胞免疫熒光下可見自噬體的存在;與自噬活動呈負(fù)相關(guān)的P62蛋白的表達(dá)量隨著orexin的刺激時間和干預(yù)濃度的延長表達(dá)含量升高，與空白組相比orexin10-7mol/L組及干預(yù)4h組的P62蛋白表達(dá)均有統(tǒng)計差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:orexin能增加體外海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性率，同時對細(xì)胞自噬活動產(chǎn)生抑制效應(yīng);該功能具有時

6、間和濃度依賴性。
　　第三部分 orexin對海馬神經(jīng)元自噬水平影響的可能機(jī)制
　　目的:初步探索orexin影響海馬神經(jīng)元自噬活性可能的機(jī)制。
　　方法:本實驗繼續(xù)選用海馬神經(jīng)元為研究對象，利用實驗二的結(jié)果選取刺激條件后(10-7mol/L、4h)，隨后從orexin和自噬兩方面進(jìn)行干預(yù)，將實驗分為空白對照組、orexin組、orexin受體阻滯劑(almorexant)組、自噬激活劑(rapamycin)組、ore

7、xin+almorexant組及orexin+rapamycin組。利用WB檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62的表達(dá)水平評估自噬水平的改變，隨后對各組標(biāo)本進(jìn)行電鏡觀察，更直觀觀察自噬體的變化。
　　結(jié)果:orexin組beclin1蛋白表達(dá)量較空白對照組下降，自噬活動抑制(p＜0.05);加入orexin受體抑制劑組、自噬激活劑的兩組細(xì)胞，與orexin干預(yù)組相比beclin1蛋白表達(dá)顯著增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05

8、);若同時加入orexin+其受體阻滯劑或同時加入orexin+自噬激活劑后，則觀察到這兩組中beclin1蛋白表達(dá)水平與對照組數(shù)值相差不大(P＞0.05)，但較單純加入orexin組相比較，表達(dá)增多(p＜0.05)。相反，實驗過程中與自噬活性呈負(fù)相關(guān)的蛋白P62的表達(dá)量在加入食欲素(orexin)刺激后表達(dá)上升，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而食欲素受體抑制劑組、自噬激活劑組中P62蛋白表達(dá)水平下降，相比與對照組有意義(P