miR-132與mecp2在REM期睡眠剝奪大鼠海馬中的表達(dá)變化及調(diào)控關(guān)系.pdf

1、睡眠剝奪(sleep deprivation, SD)是指由于各種原因引起機(jī)體睡眠質(zhì)或量的不足。人類一生的1/3時(shí)間是在睡眠中度過的，因此睡眠的好壞決定了剩下2/3生活的質(zhì)量。隨著社會(huì)的高速發(fā)展，越來越多的人遭受睡眠不足的困擾，世界衛(wèi)生組織報(bào)道睡眠剝奪已經(jīng)成為影響人健康的一個(gè)全球性問題。研究表明，長(zhǎng)期睡眠剝奪可致機(jī)體一系列損傷，例如，睡眠不足可增加患心血管疾病、充血性心力衰竭以及高血壓的風(fēng)險(xiǎn)，引起機(jī)體免疫功能減退，增加感染的可能；睡眠剝

2、奪改變了機(jī)體的內(nèi)分泌代謝，尤其是葡萄糖代謝異常，造成機(jī)體血糖升高、胰島素減少，最后導(dǎo)致胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖和高血壓；睡眠剝奪是中風(fēng)的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，睡眠不足增加機(jī)體中風(fēng)的可能；再者，睡眠剝奪損害機(jī)體腦功能，尤其對(duì)海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶的損傷目前是得到公認(rèn)的。大鼠是一種嚙齒類動(dòng)物，而嚙齒類動(dòng)物的睡眠周期與人類相似，因此，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠的睡眠剝奪模型研究睡眠障礙，為解決臨床問題提供一定的理論依據(jù)。
　　MicroRNAs是一類由

3、內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNA編碼基因通過RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ轉(zhuǎn)錄形成有發(fā)夾結(jié)構(gòu)初級(jí)RNA（Pri-miRNA），隨后被核糖核酸酶 Drosha與 DGCR8復(fù)合物剪切成前體RNA（Pre-miRNA），細(xì)胞核內(nèi)Pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞漿，被胞漿內(nèi)的另一種核糖核酸酶Dicer再加工為成熟miRNA。成熟的miRNAs通過堿基互補(bǔ)方式與靶mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA的降解或抑制蛋白的合

4、成，從而達(dá)到對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控的作用。目前，已發(fā)現(xiàn)miRNAs有1600多種，人體內(nèi)60％的蛋白質(zhì)存在miRNAs的調(diào)控位點(diǎn)，越來越多的研究表明，miRNAs在機(jī)體生理病理過程中占據(jù)重要的位置。近期，已經(jīng)在體內(nèi)檢測(cè)到睡眠剝奪后miRNAs的表達(dá)譜，微陣列技術(shù)篩查發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪后海馬部位miR-132表達(dá)上調(diào)，miR-132具有突觸重塑的功能。甲基CpG結(jié)合蛋白2（mecp2）作為一個(gè)神經(jīng)相關(guān)蛋白已經(jīng)在Rett綜合征中被廣泛研究，Rett

5、是由于mecp2基因突變，導(dǎo)致的一種神經(jīng)退行性疾病，缺失的mecp2蛋白可致海馬神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用（LTP）受損，海馬LTP被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的的分子基礎(chǔ)，而睡眠剝奪可造成海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶障礙。因此，我們假設(shè)，睡眠剝奪是否引起海馬miR-132上調(diào)而導(dǎo)致mecp2下調(diào)來影響海馬功能。本研究在成功建立大鼠改良多平臺(tái)睡眠剝奪模型的基礎(chǔ)上，探索睡眠剝奪后海馬miR-132和mecp2表達(dá)水平的具體變化，并進(jìn)一步探索mecp2在睡眠剝奪中的表

6、達(dá)是否受miR-132的調(diào)控。
　　第一部分、REM期睡眠剝奪對(duì)大鼠海馬miRNAs的影響
　　目的：探索睡眠剝奪對(duì)成年大鼠海馬miR-132、miR-138、miR-127、miR-128及Let-7b的影響。
　　方法：成年雄性Sprague-Dawley30只隨機(jī)分為對(duì)照組(con)，睡眠剝奪8h組(sd8h)，睡眠剝奪1d組(sd1)，睡眠剝奪3d組(sd3)，睡眠剝奪6d組(sd6)；采用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法

7、(MMPM)建立大鼠SD模型，SYBRA greenⅠ熒光定量RT-PCR檢測(cè)大鼠海馬miRNAs的變化
　　結(jié)果：隨著REM期睡眠剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠毛發(fā)毛糙、變黃、易激惹且飲水少；SD組大鼠與control組大鼠相比，SD組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，各SD組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RT-PCR結(jié)果顯示：（1）海馬sd8h組和sd1組miR-132水平均低于control組（P＜0.05），但sd3組高于control組（

8、P＜0.05）；（2）海馬sd8h、sd3組miR-138水平均低于control組（P＜0.01）但sd1組高于control組（P＜0.01）；（3）海馬sd8h、sd1、sd3組miR-127水平均低于control組（P＜0.05），但sd6組高于control組（P＜0.05）；（4）海馬sd1組miR-128水平低于control組（P＜0.05），sd8h組高于control組（P＜0.05）；（5）海馬sd8h、sd1、

9、sd3組let-7b水平均高于control組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：隨著睡眠剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)使海馬miR-132、miR-138、miR-127、miR-128及Let-7b發(fā)生相對(duì)應(yīng)的變化。
　　第二部分、REM期睡眠剝奪對(duì)大鼠海馬mecp2的影響
　　目的：通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-132作為SD調(diào)控基因的可能性以及它的下游靶基因，并探討睡眠剝奪后靶基因mecp2的表達(dá)變化。
　　方法：通過UCSC

10、基因組瀏覽器、人類miRNA疾病數(shù)據(jù)庫(kù)、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)、TargetScan6.2和Pubmed生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-132下游的靶基因；使用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)蛋白mecp2的變化。
　　結(jié)果：在USCS基因組瀏覽器得到人類has-miR-132定位于人17p13.3染色體的2049908～2050008位點(diǎn)，長(zhǎng)度為101bp，在人類、恒河猴、小鼠、狗中呈高度保守性；在HMDD數(shù)據(jù)庫(kù)中我們知道，

11、miR-132與癡呆、炎癥、核上性麻痹、腫瘤等有關(guān)；TargetScan6.2中顯示miR-132可能調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的多個(gè)下游基因，其中就包括mecp2；隨著REM睡眠剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，mecp2蛋白表現(xiàn)為先降低后增高的趨勢(shì)，且在SD3時(shí)最低。
　　結(jié)論：生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出mecp2可能為miR-132的靶基因；REM睡眠剝奪影響海馬部位mecp2的表達(dá)。
　　第三部分、miR-132與mecp2調(diào)控關(guān)系的研究

12、　　目的：探索miR-132與mecp2在睡眠剝奪海馬中的調(diào)控關(guān)系。
　　方法：克隆rno-miR-132和rno-mecp2的序列，并加入表達(dá)載體構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒，菌落PCR鑒定質(zhì)粒構(gòu)建情況；使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-132與mecp2間的調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果：PCR驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建成功；miR-132不能直接作用于mecp2的3’UTR預(yù)測(cè)靶點(diǎn)而調(diào)控mecp2的表達(dá)。
　　結(jié)論：miR-132可能間接調(diào)控m