MeCP2調(diào)控PTCH1表達(dá)對(duì)大鼠HSC活化增殖的影響.pdf

1、肝纖維化是各種致病因素作用于肝臟,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝臟內(nèi)過量沉積的損傷修復(fù)過程,活化的肝星狀細(xì)胞(HSC)是產(chǎn)生ECM的主要來源細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道甲基化CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)在HSC活化增殖過程中起促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究MeCP2在肝纖維化形成中的分子機(jī)制,使用小干擾RNA技術(shù)和5-雜氮-2-脫氧胞苷(5-AzadC),探討對(duì)HSC細(xì)胞活化增殖的影響,有利于發(fā)現(xiàn)潛在治療HSC細(xì)胞活化增殖的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬以TGF-β1刺激誘

2、導(dǎo)HSC活化,重點(diǎn)觀察Hedgehog(Hh)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HSC活化增殖中的作用,及MeCP2對(duì)Hedgehog(Hh)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。研究內(nèi)容主要包括以下三個(gè)部分:
　　1.大鼠肝纖維化組織中Shh、PTCH1、Gli1的表達(dá)變化
　　大鼠皮下注射CCl4制備SD大鼠肝纖維化模型,CCl4處理組(12W)和正常組各20只。自造模開始,給予CCl4花生油(體積比1:1)1ml/kg劑量皮下注射模型組SD大鼠,2次/周,

3、總計(jì)12W;給予正常組皮下注射1ml/kg劑量花生油。制備模型完畢,取出肝臟組織用于Masson膠原染色和HE染色檢測(cè),觀察大鼠肝組織中Shh、PTCH1、Gli1的表達(dá)情況,同時(shí),檢測(cè)在TGF-β1體外刺激誘導(dǎo)活化HSC過程中Shh、PTCH1、Gli1的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn),CCl4成功誘導(dǎo)肝纖維化疾病模型,PTCH1的表達(dá)在肝纖維化模型中顯著減少,Shh、Gli1的表達(dá)逐漸增高。
　　2.DNA甲基化抑制劑和MeCP2對(duì)肝星狀

4、細(xì)胞活化增殖的影響
　　利用DNA甲基化抑制劑5-AzadC和RNA干擾沉默MeCP2以觀察對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響。HSC-T6體外培養(yǎng),應(yīng)用5ng/ml TGF-β1刺激細(xì)胞24h后,然后加入5-AzadC孵育48h,MTT實(shí)驗(yàn)觀察5-AzadC對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖活性的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞周期的變化,QRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Col1A1、α-SMA的mRNA表達(dá)變化;另外,借助免疫組化和QRT-PCR實(shí)驗(yàn)觀察M

5、eCP2、α-SMA在肝纖維化模型中的表達(dá)情況。依照小RNA設(shè)計(jì)原則合成MeCP2的小干擾 RNA(RNAi),借助LipofectamineTM2000脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入HSC-T6細(xì)胞里,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞周期的變化。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):應(yīng)用5-AzadC處理HSC-T6后α-SMA、CollagenⅠ的表達(dá)水平明顯降低;提示靶向沉默MeCP2表達(dá)和5-AzadC處理后,能夠有效抑制HSC-T6的活化增殖。以上結(jié)果表明,MeC

6、P2和DNA甲基化在肝纖維化形成和HSC活化過程中發(fā)揮了重要作用。
　　3.MeCP2對(duì)PTCH1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究
　　前期研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用DNA甲基化特異性抑制劑5-AzadC處理HSC可明顯抑制其活化增殖,并可促進(jìn)PTCH1在活化的HSC中的表達(dá)。提示在HSC活化過程中DNA甲基化參與調(diào)控PTCH1的表達(dá)。據(jù)此推測(cè),PTCH1表達(dá)下降可能與PTCH1啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道,MeCP2作為DNA甲基化重要的結(jié)合