Filia泛素化修飾對FILIA蛋白調(diào)控小鼠胚胎干細胞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的作用初探.pdf

1、多能干細胞(pluripotent stem cell，PSC)的遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性對于遺傳信息的準確傳遞和機體的正常生命活動至關(guān)重要。多能干細胞包括胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)與誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)。胚胎干細胞在無限增殖過程中能保持遺傳物質(zhì)高度穩(wěn)定性。迄今為止，對維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的相關(guān)機制研究主要集中在體細胞上，而我們對胚胎干細胞維持遺傳

2、物質(zhì)穩(wěn)定性的相關(guān)機制研究并不全面，因此深入開展胚胎干細胞在遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性維持方面的相關(guān)研究有助于我們認識并了解胚胎干細胞的特性，為胚胎發(fā)育、胚胎干細胞的醫(yī)學應用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。Filia，又名Khdc3（KH domain containing 3），特異性表達于小鼠生長中的卵母細胞、囊胚以及胚胎干細胞中，是ESC維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵多功能蛋白分子。Filia可通過兩個方面的作用來維持小鼠胚胎干細胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。一、Filia

3、能與多能干細胞特異性蛋白Floped相互結(jié)合，促進停滯復制叉的重啟，減少由復制壓力所引起的細胞內(nèi)源性損傷。二、Filia參與調(diào)控小鼠胚胎干細胞的DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)，從而維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。實驗室前期工作基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ilia S151位點以及Filia S349位點對Filia的功能發(fā)揮至關(guān)重要。Filia第349位絲氨酸殘基與蛋白的入核相關(guān)，在損傷誘導情況下，F(xiàn)ilia S349能被相關(guān)激

4、酶磷酸化修飾，磷酸化的Filia能順利轉(zhuǎn)運至細胞核中，參與DNA損傷修復過程。Filia第151位絲氨酸殘基的磷酸化修飾參與復制叉重啟的過程，當復制叉受阻時，F(xiàn)ilia-Floped聚集到受阻的復制叉上，在蛋白激酶ATR的調(diào)控下，F(xiàn)ilia的第151位絲氨酸發(fā)生磷酸化，重啟復制叉。FILIA蛋白除了能被磷酸化修飾外，還能被泛素化修飾。前期FILIA的P-MS（免疫共沉淀-質(zhì)譜）結(jié)果發(fā)現(xiàn)Filia有四個泛素化位點，但我們還不清楚這四個泛素

5、化位點是否參與調(diào)控細胞的損傷修復功能，調(diào)控方式是否獨立。在本論文中，我們探究了Filia泛素化修飾在Filia蛋白調(diào)控胚胎干細胞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性及DNA損傷反應的相關(guān)功能。
　　為探究泛素化修飾是否和怎樣調(diào)控Filia在胚胎干細胞中的功能，本論文用分子克隆構(gòu)建出9個Filia泛素化位點突變的慢病毒表達載體，利用慢病毒包裝與感染等手段，得到9個Filia泛素化位點突變的小鼠胚胎干細胞系。功能研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ilia第141位賴氨酸的泛素化

6、是Filia蛋白調(diào)控DNA損傷反應的關(guān)鍵，該泛素化位點突變后，小鼠胚胎干細胞系維持較高的內(nèi)源性DNA損傷。并且FiliaK141突變后影響Filia DNA損傷修復的能力。深入探究Filia第141位賴氨酸的泛素化對損傷修復的影響機制，我們發(fā)現(xiàn)Filia K141的突變后并不影響Filia與PARP1（細胞質(zhì)中與DDR調(diào)控相關(guān)的重要蛋白修飾酶）的結(jié)合，但Filia K141突變后，F(xiàn)ilia S349不能被磷酸化，且Filia不能轉(zhuǎn)運到

7、細胞核中。綜上，F(xiàn)ilia泛素化修飾對Filia調(diào)控胚胎干細胞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性十分重要。當胚胎干細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂時，F(xiàn)ilia能定位到斷裂處，調(diào)控同源重組修復雙鏈斷裂。FiliaK141泛素化位點突變后，使Filia S349位點不能被磷酸化修飾，進而FILIA蛋白的入核受影響，F(xiàn)ILIA不能定位到受損的DNA位點，修復損傷位點。
　　盡管我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Filia K141位點十分重要，但是現(xiàn)有的證據(jù)并不能揭示Filia泛素化修