腺苷及其受體在心血管組織工程中的作用及機制研究.pdf

1、近幾年，心血管疾病的發(fā)病率以及死亡率逐年升高，臨床上對于直徑小于6 mm的組織工程血管需求量很高。以腺苷及其受體為研究工具，從五個方面深入研究局部微環(huán)境的優(yōu)化對組織工程血管長期通暢的影響。
　　一、腺苷通過調(diào)控細胞能量代謝優(yōu)化組織工程血管微環(huán)境
　　證明了腺苷可以通過能量轉(zhuǎn)換促進內(nèi)皮祖細胞的動員和歸巢，實現(xiàn)組織工程血管的早期快速內(nèi)皮化。歸巢的內(nèi)皮祖細胞在腺苷的作用下，可以分泌VEGF、SDF-1和MMP-9等血管生成因子，進

2、一步促進周圍內(nèi)皮細胞的增殖和遷移。此外，腺苷還可以通過細胞保護、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和抑制平滑肌增殖等機制優(yōu)化組織工程血管移植后的局部微環(huán)境，最終促進血管移植物的長期通暢。為了解決腺苷在循環(huán)系統(tǒng)中半衰期極短的問題，我們制作了負載有腺苷的β-環(huán)糊精/殼聚糖納米緩釋顆粒，并通過層層組裝的方式構(gòu)建了腺苷修飾的組織工程血管。組織工程血管內(nèi)表面涂層的腺苷分子能夠快速的被釋放，促進內(nèi)皮祖細胞的動員和歸巢，實現(xiàn)工程血管的快速內(nèi)皮化，而負載有腺苷的β-環(huán)糊精/

3、殼聚糖納米緩釋顆粒會緩慢地在局部釋放腺苷，長時程優(yōu)化移植的組織工程血管局部微環(huán)境，維持血管的持續(xù)通暢。
　　二、腺苷受體調(diào)控單核/巨噬細胞和內(nèi)皮祖細胞之間的Crosstalk
　　腺苷發(fā)揮生物學功能主要通過兩個途徑:直接進入細胞作為ATP生成的底物參與細胞能量代謝;與細胞表面的腺苷受體相結(jié)合，激活其下游的信號通路。適度調(diào)控移植后的炎癥反應(yīng)可能會成為維持組織工程血管通暢的一個有效的途徑。腺苷A2a受體在單核/巨噬細胞和內(nèi)皮祖細

4、胞表面均高表達，且具有促血管生成和炎癥調(diào)控等功能，因此我們將腺苷A2a受體作為一個工具，研究腺苷受體激活對組織工程血管通暢的影響。我們首先制備了羥丙級-β-環(huán)糊精/殼聚糖納米顆粒來控制腺苷A2a受體激動劑CGS21680釋放和增加其水溶性，并采用層層組裝的方式構(gòu)建CGS21680修飾的組織工程血管，其可以控制藥物在一個月內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定釋放。移植6個月后，CGS21680修飾的組織工程血管仍維持通暢，內(nèi)皮化良好。我們進一步檢測移植后不同時間段

5、組織工程血管內(nèi)單核/巨噬細胞核型的轉(zhuǎn)換，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后第3天相對于CGS21680組，對照組移植后M1型單核/巨噬細胞數(shù)量顯著升高，并隨著時間的累積進一步提升;而對照組M2型單核/巨噬細胞的數(shù)量要明顯的低于CGS21680組。體外的結(jié)果顯示內(nèi)皮祖細胞在炎性刺激下顯著表達E-selectin，促進單核/巨噬細胞核型向M1型的極化。腺苷A2a受體激活直接通過COX-2通路促進單核/巨噬細胞向M2型的極化和分泌更多的VEGF、IL-10等促血

6、管生成因子，誘導內(nèi)皮祖細胞遷移和動員;同時還可以通過降低內(nèi)皮祖細胞表面促炎分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表達，抑制單核/巨噬細胞向M1型的極化。綜上，我們的研究第一次證明了歸巢的內(nèi)皮祖細胞在炎癥刺激下，可以促進單核/巨噬細胞向M1型極化，加劇組織工程血管局部的炎癥反應(yīng);腺苷A2a受體的激活可以通過調(diào)控內(nèi)皮祖細胞和單核/巨噬細胞之間的Crosstalk，誘導移植產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)向促進血管化的趨勢發(fā)展，最終促進組織工程

7、血管的通暢。
　　三、內(nèi)源性腺苷維持組織工程血管長期通暢的作用研究
　　研究內(nèi)源性腺苷對組織工程血管長期通暢的影響能為構(gòu)建內(nèi)源性腺苷持續(xù)穩(wěn)定釋放的組織工程血管提供理論基礎(chǔ)?？紫堵屎涂讖酱笮∨c組織工程材料內(nèi)的細胞的存活、增殖和分化緊密相關(guān)。大的孔徑和相互連通的網(wǎng)絡(luò)有利于材料內(nèi)細胞與外界進行營養(yǎng)和氧氣的交換，有文獻報道維持材料內(nèi)部血管與外界進行充足的氧氣和物質(zhì)交換的最小孔徑大約為30到40 um。然而較大的孔隙率和孔徑降低了生物

8、材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。組織工程血管移植后需要經(jīng)受血液很大的流體剪切力和沖刷力，不穩(wěn)定的材料結(jié)構(gòu)容易引起組織工程血管堵塞、變形甚至破裂。有人認為組織工程血管內(nèi)層的孔徑應(yīng)該小于24um，這低于維持物質(zhì)交換所需的最小孔徑。因此組織工程血管局部的微環(huán)境在外層毛細血管長入前是一個嚴重缺氧和營養(yǎng)匱乏的微環(huán)境，不利于浸潤的單核/巨噬細胞的生存。磷酸鹽濃度的升高與心血管疾病的發(fā)生緊密相關(guān)，此外磷酸鹽濃度的升高還可以提高細胞的能量代謝，增加ATP的生成，這進

9、一步加重了移植材料內(nèi)部缺血缺氧環(huán)境下細胞的代謝負擔，加劇了細胞的損傷和死亡。Klotho蛋白是一種抗細胞衰老蛋白，與鈣磷代謝和能量代謝均緊密相關(guān)，這提示了Klotho蛋白可能具有促進內(nèi)源性腺苷釋放來發(fā)揮細胞保護的功能。我們的結(jié)果顯示Klotho蛋白能改變生物材料內(nèi)浸潤的單核/巨噬細胞對胞外高磷的應(yīng)答模式，降低能量代謝水平，維持細胞的存活和降低細胞凋亡。同時能量代謝的降低使細胞內(nèi)ATP大量降解，釋放大量的內(nèi)源性腺苷。流式檢測的結(jié)果顯示外周

10、血增多的腺苷可以打破骨髓中干細胞的靜息狀態(tài)，提高其能量代謝水平，促進更多的內(nèi)皮祖細胞向外周血動員和向單核/巨噬細胞遷移。鐵絲損傷實驗結(jié)果表明Klotho蛋白可以促進血液中增多的內(nèi)皮祖細胞歸巢到損傷的部位，通過分化形成內(nèi)皮細胞和旁分泌作用促進組織工程血管的快速內(nèi)皮化。因此我們采用β-環(huán)糊精/殼聚糖納米顆粒和層層組裝的方式構(gòu)建了Klotho蛋白修飾的組織工程血管，這種血管可以控制Klotho蛋白穩(wěn)定釋放超過一個月。移植六個月后，Klotho

11、蛋白修飾的組織工程血管的通暢率達到了90％，遠遠的高于對照組。染色和掃描電鏡的結(jié)果顯示其內(nèi)皮化程度良好，無明顯的內(nèi)膜增生和血栓形成。綜上，我們的結(jié)果證明了Klotho蛋白具有將無機磷增加的信號通過調(diào)控能量代謝的方式最終轉(zhuǎn)換為內(nèi)源性腺苷的功能，內(nèi)源性腺苷釋放的增加可以通過促進內(nèi)皮祖細胞動員和優(yōu)化局部微環(huán)境維持組織工程血管的長期通暢。
　　四、腺苷在糖尿病疾病狀態(tài)下保護內(nèi)皮祖細胞的機制研究
　　研究糖尿病條件下微環(huán)境優(yōu)化和干細胞

12、保護對于構(gòu)建抗高糖損傷的組織工程血管具有十分重要的意義。自噬是機體內(nèi)一個重要的生理現(xiàn)象，可以將代謝廢物轉(zhuǎn)化為氨基酸等細胞進行三羧酸循環(huán)所必須的原料，加速細胞代謝廢物清除。我們的研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者體內(nèi)，內(nèi)皮祖細胞的自噬水平顯著下降，而能量代謝的水平則顯著升高，自噬與能量代謝穩(wěn)態(tài)失衡最終引起內(nèi)皮祖細胞促血管生成功能受損，甚至死亡。腺苷通過增加內(nèi)皮祖細胞的自噬水平，維持自噬與能量代謝穩(wěn)態(tài)的平衡，保護內(nèi)皮祖細胞免受高糖的損傷和促進其向內(nèi)皮細胞

13、分化。為了在體驗證腺苷對內(nèi)皮祖細胞的保護作用，我們選擇了糖尿病潰瘍作為動物驗證模型。內(nèi)皮祖細胞在受腺苷刺激后種植到提前制備好的可降解生物材料上，培養(yǎng)48小時后移植到糖尿病潰瘍的表面。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺苷顯著增強內(nèi)皮祖細胞-生物材料對糖尿病潰瘍愈合的治療作用，其機制是腺苷通過自噬保護移植內(nèi)皮祖細胞促血管生成功能和促進其分化。綜上我們的研究發(fā)現(xiàn)腺苷可以作為抗高糖損傷組織工程血管的一個構(gòu)建靶點，來發(fā)揮細胞保護和促血管生成的功能。
　　五、抗高糖

14、損傷組織工程血管的構(gòu)建
　　腺苷具有內(nèi)皮祖細胞動員歸巢、干細胞保護和微環(huán)境優(yōu)化等生物學功能，然而將其直接應(yīng)用于糖尿病的血管替代治療效果卻很不理想，目前還未見可用于糖尿病血管替代的組織工程血管的成功報道。究其原因，主要是由于糖尿病外周血中的內(nèi)皮祖細胞的遷移、旁分泌和分化等促血管生成的功能受到了嚴重的損害，歸巢到組織工程血管內(nèi)表面不能促進血管的快速內(nèi)皮化;同時糖尿病體內(nèi)高糖和氧化應(yīng)激的微環(huán)境加劇了組織工程血管移植后的炎癥反應(yīng)，進而對歸

15、巢的干細胞造成了進一步的損傷。適合糖尿病的組織工程血管理想涂層藥物至少需要同時具備干細胞捕獲、恢復受損的干細胞功能、抵御高糖損傷和優(yōu)化局部微環(huán)境四個功能。腺苷激酶(ADK)是一種催化腺苷生成ATP的核苷激酶，研究表明腺苷激酶表達上調(diào)會加速缺血條件下細胞的損傷和死亡，而腺苷激酶抑制有助于維持組織損傷狀態(tài)下細胞能量代謝的維持，抵御疾病的損傷。同時腺苷激酶抑制的細胞可以持續(xù)的釋放腺苷，腺苷是一種局部微環(huán)境的優(yōu)化分子，具有調(diào)控炎癥反應(yīng)、細胞保護

16、和促進血管生成等作用。這些都說明了腺苷激酶可以作為糖尿病狀態(tài)下干細胞基因調(diào)控作用靶點的可能性。因此，我們構(gòu)建了CD133/ADK嵌合體修飾的組織工程血管血管，其在糖尿病大鼠體內(nèi)移植30天后依舊維持通暢，沒有顯著的內(nèi)膜增生和血栓形成。我們的組織工程血管由組織工程血管支架和CD133/ADK嵌合體兩個部分構(gòu)成，移植前兩個部分混合可以自組裝形成穩(wěn)定的RNA修飾的組織工程血管。我們準備了聚醚酰亞胺(PEI)/金納米顆粒，顆粒大小約為200nm。

17、制備過程中四氯合金酸(HAuCl4)的升高，降低了PEI/金納米顆粒的轉(zhuǎn)染能力，進而來減少RNA轉(zhuǎn)染的非特異性;同時還增加組織工程血管的穩(wěn)定性和生物相容性，更能抵抗循環(huán)系統(tǒng)的剪切和沖刷。CD133/ADK嵌合體由CD133適配體RNA和ADK SiRNA構(gòu)成，CD133適配體特異性的捕獲循環(huán)中的CD133陽性細胞。捕獲的細胞能內(nèi)吞結(jié)合的嵌合體，在細胞內(nèi)Dicer酶的特異性剪切下形成ADK SiRNA，改善CD133陽性細胞受損的促血管生